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Cinétique enzymatique Equation de Michaelis et Menten.

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1 Cinétique enzymatique Equation de Michaelis et Menten

2 Les trois phases dune réaction enzymatique: msec: « phase initiale » (formation du complexe ES) quelques minutes (heures): « état stationnaire » ( [ES] constant, vitesse constante ) Après quelques heures: « approche de léquilibre » (disparition progressive du substrat, vitesse diminue)

3 Incubation longue (généralement quelques heures): Etat Stationnaire:

4 Incubation moyenne (généralement quelques minutes): Produit Temps On parle détat stationnaire tant que la vitesse de la réaction reste constante. [S]=1 mM [S]=3 mM [S]=10 mM [S]=30 mM

5 A létat stationnaire: lorsque la concentration du substrat, [S], augmente, la vitesse initiale de la réaction, v, augmente hyperboliquement. Interprétation???

6 Observations: Quelque soit la concentration de S, la vitesse est proportionnelle à [E]. A faible concentration de S, la vitesse est proportionnelle à [S]. La loi daction des masses nous apprend que si v=[E][S] cest que la réaction passe par une étape: E+S-- >P A forte concentration de S, la vitesse ne dépend plus de [S] mais reste proportionnelle à E Hypothèse: La vitesse est en fait proportionnelle à [ES] ? [E]+[S] [ ES] [E]+[P]

7 ESESEP k cat k 1 k 1 () La loi daction des masses prédit que: Tant que [ES] reste constant, le produit apparaît à une vitesse constante: on parle alors détat stationnaire

8 Méthode traditionnelle de calcul: On pose: 1. état stationnaire, 2. Conservation des masses:

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10 Méthode alternative: 1

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13 Représentation de Michaelis-Menten

14 Une autre façon de voir les choses: Traditionnellement, on étudie les enzymes purs, agissant sur des substrats purs, dans un tube à essai. On sintéresse de plus en plus aux enzymes tels quils fonctionnent en cascade, « in vivo », et non pas isolés dans un tube à essai. On parle alors de « flux enzymatique »:

15 Le moindre étranglement entre deux « bassins » peut provoquer le débordement des bassins en amont, linterruption du flux en aval… Quelles sont les conséquences dune modification de K M, dune diminution de V max ?

16 Imaginons la voie métabolique comme un Canal dont le flux est régulé par une série décluses: Forme de louverture de lécluse?

17 Nous allons calculer la forme de lécluse, tel que le flux de leau sécoulant du bassin précédent se comporte comme le « flux enzymatique » à travers une réaction Michaelienne:

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19 [Substrate] / K M v (in % of V max ) [Substrate] / K M d (v) / d ([S]) in % of (V max / K M )

20 Représentons chaque enzyme par une écluse, permettant lécoulement de leau: Surface = vitesse –Plus large en bas (v si [S]) –Étroit en haut (v V max ) –Largeur maximale: en [S] 0, dv/dS V max /K M –Largeur minimale: –en [S], dv/dS 0

21 Représentation de la porte décluse [Substrate] / K M d (v) / d ([S]) in % of (V max / K M ) Enzyme lock gate [Substrate ]

22 Représentons chaque enzyme par une écluse, permettant lécoulement de leau: Surface = vitesse –Plus large en bas (v si [S]) –Étroit en haut (v V max ) –Largeur maximale: en [S] 0, dv/dS V max /K M –Largeur minimale: –en [S], dv/dS 0

23 Représentons chaque enzyme par une écluse, permettant lécoulement de leau: (V max /K M ) [S]

24 Réactions en présence dun mélange de plusieurs substrats possibles: Spécificité et K S

25 S1 et S2 séparés: P1 P2 Spécificité: Supposons une enzyme capable dagir sur deux substrats, S1 et S2: comment savoir quel est sur quel substrat elle agira « de préférence » si ils sont présents simultanément dans la cellule ou mélange réactionnel étudié?

26 1 enzyme, 2 substrats mélangés: S 1 ES 1 + P 1 E + E S 2 ES 2 + P 2

27 K S :mesure de la spécificité dune enzyme K S= k cat /K M permet de quantifier la vitesse relative de la réaction dintérêt lorsque lenzyme est en présence de plusieurs substrats (« spécificité):

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30 « K S » et vitesse dassociation E S

31 Autre signification de K S :

32 Limite maximum de K S ?

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34 Modification de léquilibre?

35 Equilibre: relations de Briggs-Haldane

36 Léquilibre ne peut être modifié par les enzymes. La catalyse est donc toujours « aussi efficace » dans un sens que dans lautre?

37 Réactions à « sens unique »:

38 Exemple: SAM synthase

39 Enzyme « idéale »? k 1 grand, k -1 petit, k cat grand : Spécificité, efficacité?

40 Comment varie la vitesse de la réaction lorsque x augmente de …%? Δ[S] v ΔvΔv [S] Si [S] grand, v augmente moins vite que [S]. Pour exprimer cette relation: écrire

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42 Si k 1 augmente de …%?

43 Evolution de la vitesse quand k 1 augmente: Conclusion: la vitesse de la réaction augmente avec k 1, dautant plus que k 1 petit. k1k1

44 Conclusion: la vitesse de la réaction diminue lorsque k -1 augmente, dautant plus que k -1 grand. lorsque k -1 augmente de …%?

45 Conclusion: la vitesse de la réaction augmente avec k cat, dautant plus que k cat est petit. lorsque k cat augmente de …%?

46 Pour résumer: La réaction sera dautant plus rapide (à 1 concentration de substrat donnée) que: –k 1, (reconnaissance enzyme-substrat), est grand; –k cat, (transformation de ES en E+P) est grand, –k -1, (dissociation du substrat avant transformation), est faible.

47 Comment augmenter la spécificité de lenzyme? 1.Vaut-il mieux que le bon substrat ait un grand K S ? Que le mauvais substrat ait un faible K S ? Ou les deux? 2.Comment faire? (Comment varie K S en fonction de k 1, k -1 et k cat ?)

48 Suffit-il daugmenter K S pour le « bon » substrat? Une enzyme sera considérée comme « spécifique » si elle agit sur un seul substrat, même en présence de nombreux autres composés très semblables. Pour atteindre ce but, il ne suffit pas que la valeur du K S du « bon » substrat soit élevée:

49 Comment varie K S lorsque k 1 augmente de …%? La constante de spécificité augmente proportionnellement à k 1. k 1 reflète le nombre de collisions « productives » entre enzyme et substrat: varie peu dun composé à lautre (sauf si guidage par interactions ioniques) k1k1

50 lorsque k -1 augmente de …%? K S diminue lorsque k -1 augmente, dautant plus que k -1 est grand. les substrats qui dissocient lentement du site actif avant transformation seront transformés de préférence. Importance dinteractions à courte distance. k -1 ou k cat

51 k cat K S augmente avec k cat, surtout si k cat faible lorsque k cat augmente de …%?

52 Résumé: variation de K S K S est toujours proportionnel à k 1. K S diminue si k -1 augmente, surtout si k -1 grand. K S augmente avec k cat surtout si k cat petit

53 Spécificité ou efficacité? En résumé: Si lenzyme peut utiliser deux (ou plusieurs) substrats: pour quil soit spécifique, il faut que K S = k cat /K M diffère le plus possible dun substrat à lautre. La vitesse de la réaction et K S augmentent lorsque k 1 augmente, lorsque k cat augmente et lorsque k -1 diminue : le guidage électronique et la rétention du substrat dans le site actif peuvent augmenter à la fois la vitesse de réaction et sa spécificité.

54 Analyse cinétique: linéarisation Lineweaver-Burke, Hanes ou Woolf, Eadie - Hofstee, Linéaire direct

55 Avantage: statistiquement correct (y varie, x constant) Inconvénient: non linéaire! Analyse difficile. Michaelis Menten:

56 Double réciproque : Lineweaver-Burk (1934) Très populaire: diminue souvent limpression de dispersion des résultats. Problème: erreurs amplifiées à petit substrat donc grand 1/S (à droite du graphe).

57 Hanes, ou Woolf Avantage: les erreurs sont « normalisées » et constantes. Inconvénient: toute erreur sur K M est reportée sur V max.

58 Eadie-Hofstee: v v/[S] V max V max /K M Pente: -K M Rare. Les erreurs sont « obliques », et amplifiées à haut [S]! Avantage: très sensible à toute déviation de «Michaelis- Menten ».

59 Graphique direct linéaire (Eisenthal et Cornish-Bowden) Principe: Chaque paire de valeurs v et [S] est compatible avec une infinité de valeurs de K M et V max, distribués sur une droite déquation: équivalente à:

60 Application: tracer chacune de ces droites: leur intersection correspond à la seule valeur de K M et V max qui soit compatible avec tous les résultats. v1v1 v2v2 v3v3 S1S1 S2S2 S3S3 [S] v KMKM V max

61 En réalité, pas intersection « unique » (erreurs exp.). Il faut chercher le centre de gravité de toutes les intersections… Pas pour publication, (pas « joli »), mais pratique pour estimer V max, K M sur un coin de table de labo… v [S] v1v1 v2v2 v3v3 S1S1 S2S2 S3S3 v4v4 S4S4

62 Constantes: Définitions et dimensions

63 KMKM

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65 K M = (k -1 + k cat )/ k 1 : –k 1 : M -1 sec -1 –k -1 : sec -1 –k cat : sec -1 K M : (sec -1 )/(M -1 sec -1 ) = 1/M -1 = M K M est une concentration (M ou mol/l) Dimensions:

66 V max La vitesse maximum ou V max est une limite théorique, jamais atteinte en pratique! (Il est impossible dobtenir une concentration infinie en substrat!) On peut néanmoins utiliser cette limite pour estimer le nombre de molécules de substrat transformées par le complexe enzyme substrat en une seconde, minute, etc. Ce « turnover number » (débit) donne une idée de lefficacité de la catalyse, surtout quand on le compare avec la réaction non catalysée…

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68 v et V max : mol/sec ou mol/min Quantité denzyme: vitesse, exprimée en « Unités » (µmol/min), ou en « katals » (mol/sec) Quantité denzyme : dimensions

69 Quantité denzyme: Unités courantes Unité (U): quantité denzyme catalysant la transformation de 1 µmole de substrat par minute dans les conditions standard (généralement à 25°C, dans les conditions optimales de pH, et de force ionique, en présence des cofacteurs et coenzymes nécessaires en quantité suffisante…). Typiquement, de lordre de 0.1 – 100 μg denzyme pur, ou de lordre de mg pour les préparations industrielles denzyme. Remarque: les conditions de mesure de lactivité doivent être clairement définies par le fournisseur! Unités « CGS » (internationales) katal (kat), quantité denzyme catalysant la transformation de 1 mole de substrat par seconde dans les conditions standard. (1 kat = U ou quelques kilos denzyme pur; 60 U = 1µkat). (Problème: une mole = 180 g de glucose, quelques kilos de protéine…!)

70 KSKS

71 K S = k 1 k cat / (k -1 + k cat ) : –k 1 : M -1 sec -1 –k -1 : sec -1 –k cat : sec -1 K S : (M -1 sec -1 ) (sec -1 ) / (sec -1 ) = M -1 sec -1 K S a les dimensions dune constante de vitesse dassociation Dimensions:

72 Un flux minimum peut être indispensable pour permettre la survie: Plutôt que de calculer la vitesse imposée par la [S], on devrait calculer la [S] nécessaire pour maintenir une certaine vitesse. Survie impossible Vitesse de production [Substrat] nécessaire

73 Nécessité dautres modèles: Enzymes allostériques: –Enzymes régulées par des composés ne ressemblant ni au substrat, ni au produit de la réaction Exemples: inhibition de la phosphofructokinase par lATP, … Enzymes coopératives: –Courbe cinétique de forme « sigmoïde » (vitesse de réaction proportionnelle à [S] n lorsque [S] est faible) Remarque: la majorité des enzymes coopératives sont également régulées allostériquement, et beaucoup denzymes allostériques sont également coopératives vis-à-vis dau moins un substrat!

74 Exemple denzyme coopérative : Aspartate transcarbamoylase bactérienne ZOOM: +ATP +CTP Controle +ATP +CTP Controle Début de la synthèse des bases puriques: (d)CTP, UTP, dTTP; Inhibé lorsque les purines sont disponibles; activé lorsque les pyrimidines ( (d)ATP, (d)GTP ) sont disponibles

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76 Aspartate Transcarbamoylase bactérienne INACTIVE (T)ACTIVE (R) Vue du haut: C C C C C R R R R Vue de profil: R C C

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78 Forme de la courbe: justification? Lenzyme coopérative existe en 2 conformations: R et T. A faibles [S], T prédomine; les courbes v et T sont confondues à très petit [S]. Lorsque [S] augmente, le % R augmente: la vitesse se rapproche de la courbe R [S] vitessevitesse vitessevitesse T R T R

79 AMP Sucres (glycogène) Enzyme allostérique de type « V »: la glycogène phosphorylase Ser-PO 4 Sites actifs

80 Enzyme Michaelienne versus coopérative: apparement pas grande différence au niveau des vitesses?

81 Mais…pas du tout le même effet sur le « Flux » à travers la voie métabolique: {orifice large à la base, de plus en plus étroit car la vitesse augmente moins que [S] à toutes [S]} {orifice étroit à la base, sélargit (la vitesse augmente plus que [S] lorsque [S] est très faible), puis redevient très étroit (la vitesse augmente moins que [S] lorsque [S] est grand)}

82 Pourquoi? Zoom sur les petites concentrations de Substrat: Enzyme Michaelienne: v varie moins que S, pente max en [S] 0 Enzyme coopérative: v varie plus que S pente 0 en [S] 0

83 Enzymes coopératives: Modèle de Monod, Jacob et Changeux Modèle de Koshland, Nemethy et Filmer

84 Monod, Jacob et Changeux: TR SS SS SS SS

85 Koshland, Nemethy et Filmer: S S SS SS Equation encore plus complexe (2 complexes ES 2 différents)

86 La réalité: un mélange de ces deux modèles?

87 Régulation dune enzyme coopérative par des régulateurs allostériques: Enzyme allostérique, 2 sites (T/R = 100) Enzyme allostérique activé (T/R = 10) Enzyme allostérique inhibé (T/R = 1000) Inhibiteur stabilisant T Activateur, stabilisant R

88 Régulation dune enzyme coopérative et allostérique: Inhibiteur stabilisant la conformation « T »


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