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Biologie Moléculaire Travailler avec lADN. Sujets ADN Genomique vs. Vecteur ADN Genomique vs. Vecteur Purification dADN plasmidique Purification dADN.

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1 Biologie Moléculaire Travailler avec lADN

2 Sujets ADN Genomique vs. Vecteur ADN Genomique vs. Vecteur Purification dADN plasmidique Purification dADN plasmidique Enzyme de restriction Enzyme de restriction Essentielle de la cartographie de restriction Essentielle de la cartographie de restriction

3 ADN Genomique Genomique Prokaryote vs. eukaryote Prokaryote vs. eukaryote Circulaire ou linéaire Circulaire ou linéaire Un ou plus dun chromosomes Un ou plus dun chromosomes Extra-genomique Extra-genomique Vecteurs Vecteurs Plasmides Plasmides

4 Vecteurs Vs Plasmides Vecteur: Vecteur: Véhicule dADN permettant le clonage, maintien et amplification dune séquence dADN Véhicule dADN permettant le clonage, maintien et amplification dune séquence dADN Plasmides Plasmides Virus Virus Chromosomes Chromosomes Tous les plasmides sont des vecteurs Tous les plasmides sont des vecteurs Pas tous les vecteurs sont des plasmides Pas tous les vecteurs sont des plasmides

5 Plasmides Petites molécules dADN circulaires maintenues et amplifiées chez des cellules eucaryotes ou procaryotes Petites molécules dADN circulaires maintenues et amplifiées chez des cellules eucaryotes ou procaryotes Amplification chez les bactéries Amplification chez les bactéries Utilisé en tant que vecteur pour le clonage ou lexpression dADN dintérêt Utilisé en tant que vecteur pour le clonage ou lexpression dADN dintérêt

6 Caractéristiques des Vecteurs Plasmidiques Sites de restrictions uniques pour le clonage Origine de réplication (Ori) Marqueur de sélection Gènes de résistance aux antibiotiques

7 Isolation dADN Buts Buts Isolation de lADN désiré Isolation de lADN désiré Chromosomique ou plasmidique? Chromosomique ou plasmidique? Retirer les autres composantes Retirer les autres composantes ADN chromosomique ou plasmidique? ADN chromosomique ou plasmidique? Protéines Protéines ARN ARN Produits chimiques Produits chimiques Sels, détergents, etc. Sels, détergents, etc.

8 Lyse cellulaire Lyse cellulaire Paroi et membrane Paroi et membrane Enzymatique Enzymatique Chimique Chimique Mécanique Mécanique Isolation de lADN désiré Isolation de lADN désiré Sédimentation différentielle Sédimentation différentielle Chromatographie Chromatographie Retirer les autres composantes Retirer les autres composantes Enzymatique Enzymatique Sédimentation différentielle Sédimentation différentielle Chromatographie Chromatographie Isolation dADN (suite)

9 Isolation dADN Plasmidique par Lyse Alcaline (E.coli )

10 Solutions Utilisées Sol. I – Tampon de suspension Sol. I – Tampon de suspension Tris HCl - Tampon, protège les acides nucléiques Tris HCl - Tampon, protège les acides nucléiques EDTA - Chélates Mg++, empêche les nucléases de fonctionner EDTA - Chélates Mg++, empêche les nucléases de fonctionner Sol. II – Solution de lyse Sol. II – Solution de lyse NaOH - ^pH lyse cellulaire, dénature ADN NaOH - ^pH lyse cellulaire, dénature ADN SDS - dissous membranes, denture et lie protéines SDS - dissous membranes, denture et lie protéines

11 Solutions Utilisées (suite) Sol. III- Acétate de potassium Sol. III- Acétate de potassium Renaturation de lADN Renaturation de lADN Précipite SDS Précipite SDS Précipite ADN génomique et protéines Précipite ADN génomique et protéines Isopropanol / Éthanol Isopropanol / Éthanol Précipite acides nucléiques (plasmide et ?) Précipite acides nucléiques (plasmide et ?) Sels demeurent solubles Sels demeurent solubles TE-RNase - Tris & EDTA encore; RNase?? TE-RNase - Tris & EDTA encore; RNase??

12 Quantification de lDNA Déterminer la Conc. dDNA Déterminer la Conc. dDNA A260 de 1.0 = 50µg/mL ou 50ng/µL A260 de 1.0 = 50µg/mL ou 50ng/µL Déterminer la quantité dDNA Déterminer la quantité dDNA 1mL dune solution avec une A260 de 1.0 contient 50µg DNA 1mL dune solution avec une A260 de 1.0 contient 50µg DNA 1µL dune solution avec une A260 de 1.0 contient 50ng DNA 1µL dune solution avec une A260 de 1.0 contient 50ng DNA Ne pas oublier de prendre en considération le FACTEUR DE DILUTION Ne pas oublier de prendre en considération le FACTEUR DE DILUTION

13 Enzymes de Restriction Clive les liens phosphodiester internes Clive les liens phosphodiester internes Reconnaissent des séquences doubles brins spécifiques Reconnaissent des séquences doubles brins spécifiques Différentes endonucléases reconnaissent différentes séquences Différentes endonucléases reconnaissent différentes séquences Reconnaissent des séquences palindromes Reconnaissent des séquences palindromes

14 Palindromes La même séquence est lue dans la direction 5» 3 sur les deux brins La même séquence est lue dans la direction 5» 3 sur les deux brins 5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5

15 Les mêmes liens phosphodiesters sont clivés sur les deux brins! Les mêmes liens phosphodiesters sont clivés sur les deux brins! 5-G5-G 3-C3-CCTAG GATCC-3C-3 G-5G-5

16 Différentes Extrémités sont Générées 5-G5-G 3-C3-CCT GA AG TCC-3C-3 G-5G-5 Extrémités franches

17 Différentes Extrémités sont Générées Extrémités 5 protubérantes 5-G5-G 3-C3-CCTAG GATCC-3C-3 G-5G-5

18 Différentes Extrémités sont Générées Extrémités 3 protubérantes 3-C3-C 5-G5-GGATCC-3C-3 CTAGG-5G-5

19 Compatibilité des Extrémités O P O P Extrémités franches HO P OH P Compatible

20 Compatibilité des Extrémités Extrémités Protubérantes HO P OH P HO PO P Incompatible

21 Compatibilité des Extrémités Extrémités Protubérantes HO P OH P HO PO P Incompatible

22 Compatibilité des Extrémités Extrémités Protubérantes P-CTAG HO GATC-P OH Compatible P-CTAG OGATC-P O Appariement

23 Compatibilité des Extrémités Extrémités protubérantes P-TCCA HO GATC-P OH Incompatible P-TCCA HO GATC-P OH Appariement

24 Cartographie des Sites de Restrictions

25 LADN est-il digéré? Doit comparer à un témoin non digéré D1NDD2

26 La digestion est-elle complète? ND D1D2 Doit comparer à un témoin non-digéré Partiel Complet

27 Digestion partielle Toutes les molécules cibles ne sont pas coupées à toutes les sites possibles! Toutes les molécules cibles ne sont pas coupées à toutes les sites possibles! Génère différents produits intermédiaires Génère différents produits intermédiaires

28 Produit dune digestion complète Produit dune digestion partielle (intermédiaire) Produit dune digestion partielle (intermédiaire) Digestion partielle

29 Complète Vs Partielle Une digestion complète donne une stoechiométrie de 1:1:1… Une digestion complète donne une stoechiométrie de 1:1:1… Le nombre de molécules de chacun des différents fragments est le même! Le nombre de molécules de chacun des différents fragments est le même! La stoechiométrie dune digestion partielle est variable: La stoechiométrie dune digestion partielle est variable: Ex. 1:3:2… Ex. 1:3:2…

30 Ex Combien de molécules de chacun des fragments seraient générées suite à une digestion complète? 3; donc une stœchiométrie de 3:3:3 =1:1:1 Combien de molécules de chacun des fragments seraient générées suite à une digestion partielle?

31 Évaluer la Stœchiométrie sur Gel dAgarose Principe Principe La quantité de bromure déthidium qui lie lADN est proportionnelle à la taille de lADN La quantité de bromure déthidium qui lie lADN est proportionnelle à la taille de lADN La quantité de bromure déthidium qui lie lADN est proportionnelle à la quantité dADN La quantité de bromure déthidium qui lie lADN est proportionnelle à la quantité dADN Dans le cas dune digestion complète, la quantité de bromure déthidium qui lie lADN est seulement proportionnelle à la taille de lADN Dans le cas dune digestion complète, la quantité de bromure déthidium qui lie lADN est seulement proportionnelle à la taille de lADN Pourquoi? Pourquoi?

32 Ex. D1 Stœchiométrie pas respectée Stœchiométrie respectée D2 Stœchiométrie pas respectée Stœchiométrie respectée

33 Exemples

34 Exemples

35 1 ière étape: Déterminer le nombre de coupures Est-ce que lADN a été digéré? Est-ce que lADN a été digéré? Non- Aucune cartographie requise Non- Aucune cartographie requise Oui Oui La digestion est-elle complète? La digestion est-elle complète? La digestion est-elle partielle? La digestion est-elle partielle? Quels produits sont des intermédiaires Quels produits sont des intermédiaires Combien de fois lADN a-t-il coupé Combien de fois lADN a-t-il coupé Les coupures sont dans le vecteur Les coupures sont dans le vecteur Aucune cartographie requise Aucune cartographie requise Les coupures sont dans linsertion Les coupures sont dans linsertion Cartographie requise Cartographie requise

36 Combien de Sites de Restriction est-ce quil y a? ADN linéaire (ex. Chromosome humain) ADN linéaire (ex. Chromosome humain) Le nombre de coupures est égal au nombre de fragments moins un Le nombre de coupures est égal au nombre de fragments moins un ADN circulaire (ex. Plasmide) ADN circulaire (ex. Plasmide) Le nombre de coupures est égal au nombre de fragments Le nombre de coupures est égal au nombre de fragments

37 Les coupures sont-elles dans linsertion ou le vecteur? B coupe 2 fois dans le vecteur et 0 fois dans linsertion E coupe 1 fois dans le vecteur et 1 fois dans linsertion P coupe 1 fois dans le vecteur et 2 fois dans linsertion insert B B E ? S Taille du vecteur 2.5kpb P PE M NDVB

38 2 e Étape: Quelles sont les positions des sites de restrictions? Cartographie relative est faite Cartographie relative est faite Les sites de restriction sont cartographiés en relation en un point de référence Les sites de restriction sont cartographiés en relation en un point de référence La position du point de référence doit être connue La position du point de référence doit être connue

39 Dois Déterminer la Taille de lInsertion 1.Déterminer la taille des fragments issus dune digestion complète 2.Déterminer la taille totale du plasmide (Somme des tailles) 3.Déterminer la taille de linsertion (Taille du plasmide - Taille du vecteur) PE M NDVB insert B B E ? S Taille du vecteur 2.5kpb P

40 Déterminer les Tailles PE Ec EnzDistance (cm) Tailles pb P E Donc : Taille du plasmide 5Kpb Taille de linsertion 5000pb – 2500pb = 2500pb

41 Cartographie du Site P Insertion (2.5kpb) P 1.1kbp ou P 1.1kbp P Impossible puisque le second site doit être dans linsert! Insertion (2.5kpb) P 0.9kbp ou P 0.9kbp P Impossible puisque le second site doit être dans linsert!

42 Cartographie du Site P (Suite) Insertion (2.5kpb) P 1.1kbp P 0.9kbp P Insert (2.5kpb) P 0.9kbp P 1.1kbp P Ou

43 Déterminer lOrientation Insertion (2.5kpb) P 1.0kbp EE

44 Déterminer lOrientation Insertion (2.5kpb) P 1.1kbp P 0.9kbp P Insert (2.5kpb) P 0.9kbp P 1.1kbp P Or 1.0kbp EE EE

45 Déterminer lOrientation Ec NDPEP+E


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