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Travail de génétique Analyse de lexpression des gènes mis en jeu lors de la phase aigue de linflammation en utilisant un modèle des régions codantes chez.

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1 Travail de génétique Analyse de lexpression des gènes mis en jeu lors de la phase aigue de linflammation en utilisant un modèle des régions codantes chez le chien Sophie Bitté Sophie Bitté Flora Bonnet Flora Bonnet Anne-Sophie Bouix Anne-Sophie Bouix Marthe Woygnet Marthe Woygnet 2ème doctorat

2 PLAN I. Objectifs II. Matériel et méthodes III. Résultats et discussion IV. Conclusion V. Intérêts Bibliographie

3 Objectifs Similitudes entre chien et homme dans réponse face à des cas de toxicité de certains médic.humains. Similitudes entre chien et homme dans réponse face à des cas de toxicité de certains médic.humains. !!! Attention aux extrapolations dinfos erronées!!! !!! Attention aux extrapolations dinfos erronées!!! lancement dune étude sur le séquençage et lexpression du génome du chien lancement dune étude sur le séquençage et lexpression du génome du chien identification de marqueurs biologiques compréhension des mécas daction mis en jeu identification de marqueurs biologiques compréhension des mécas daction mis en jeu importance capitale pour lindustrie pharmaceutique importance capitale pour lindustrie pharmaceutique Peu dinformations disponibles et coût élevé ( rongeurs)

4 Identification des mécanismes des marqueurs biologiques mis en jeu grâce à lutilisation dune sonde reconnaissant spécifiquement des régions codantes du génome canin. Identification des mécanismes des marqueurs biologiques mis en jeu grâce à lutilisation dune sonde reconnaissant spécifiquement des régions codantes du génome canin. Sonde contient des séquences canines et humaines Sonde contient des séquences canines et humaines compréhension action moléculaire au niveau voies métaboliques, organes cibles, sites daction face à un compréhension action moléculaire au niveau voies métaboliques, organes cibles, sites daction face à un cas de toxicité. cas de toxicité. Séquences humaines: augmente capacité dexpression des séquences possibilités comparaison directe entre génomes humain et canin

5 Cette toxicité résulte de ladministration à des chiens de LPS, mimant ainsi une situation endotoxique. Cette toxicité résulte de ladministration à des chiens de LPS, mimant ainsi une situation endotoxique. Choix de ce modèle en raison des similitudes à travers les espèces au niveau des marqueurs traditionnels de la phase aigue de la RI Choix de ce modèle en raison des similitudes à travers les espèces au niveau des marqueurs traditionnels de la phase aigue de la RI comparaison possible entre les profils de transcrits, formules sanguines, paramètres hématologiques du chien avec ceux dautres espèces, et notamment de lhomme comparaison possible entre les profils de transcrits, formules sanguines, paramètres hématologiques du chien avec ceux dautres espèces, et notamment de lhomme

6 Matériel et Méthodes Séquence codante canine Séquence codante canine séquence doligonucléotides obtenue à partir du modèle de la séquence U133 humaine ( 12,8 mm) sites reconnus par la sonde dans la séquence construite spécifiques au chien ( dont issus du domaine privé et 3650 de la banque génétique publique) 8945 sites de référence humaine synthèse par photolithographie

7 Conception et sélection de la sonde Conception et sélection de la sonde attribution score de qualité pour chaque sonde, basée sur lefficacité de lhybridation. classification des sondes suivant divers paramètres

8 Animaux détudes Animaux détudes 9 beagles mâles de 8 à 25 mois, et de 5 à 11 kg. période dadaptation de 3 semaines ration: 300 g le matin et eau à volonté formation 3 groupes (contrôle, LPS 4h, LPS 24h) ~ chiens traités : dose unique en IV de 0,2 mg/kg de LPS en solution saline ~ chiens contrôles : injection de lexcipient uniquement mise à jeun la nuit précédent linjection, et 4h avant leuthanasie euthanasie des animaux 4h ( groupe 2), ou 24h (groupe 3) après ladministration de LPS

9 Evaluation des paramètres hématologiques et chimiques Evaluation des paramètres hématologiques et chimiques collecte déchantillons sanguins tube avec EDTA: détermination du taux de réticulocytes, plaquettes, leucocytes… tube avec EDTA: détermination du taux de réticulocytes, plaquettes, leucocytes… tube avec citrate de sodium: détermination de prothrombine et thromboplastine, via une centrifugation pendant 10 min. à 3000 tours/min. tube avec citrate de sodium: détermination de prothrombine et thromboplastine, via une centrifugation pendant 10 min. à 3000 tours/min.

10 tube sans anti-coagulant: détermination des concentrations en glucose, cholestérol, triglycérides…, via une centrifugation; et détermination de lactivité de ALP, GGT, ALT, AST. tube sans anti-coagulant: détermination des concentrations en glucose, cholestérol, triglycérides…, via une centrifugation; et détermination de lactivité de ALP, GGT, ALT, AST. kits immunologique: détermination des concentrations de SAA et CMP kits immunologique: détermination des concentrations de SAA et CMP évaluations histopathologiques sur le foie, le cœur, les reins et les tissus du tractus gastro- intestinal évaluations histopathologiques sur le foie, le cœur, les reins et les tissus du tractus gastro- intestinal

11 Préparation des échantillons prélèvement de 150 mg de foie et homogénéisation dans 1 ml dARN stat.60 extraction ARN total Purification ARN sur colonnes Mise en solution avec ARN canin Transcription inverse en double brin dADN synthèse ARN puis fragmentation Hybridation avec la sonde canine

12 Méthodes damplification rapide dune séquence dADN: PCR utilisée pour confirmer la série de changements transcriptionnels observés lors de lexpérience. utilisation damorces pour certains gènes spécifiques SAA, Il 8, ND 5, TIMP1, SDF2L1 suivi du protocole classique, 3 fois par prélèvement. Traitement ARN par ADNase et Transcription inverse Electrophorèse des produits obtenus Incubation des tubes à PCR pendant 2 min à 50°C Dénaturation des proteines à 95°C pendant 10 min Série dincubations,± 50, à 95°C pdt 15 sec, puis 60° pdt 1 min

13 RESULTATS RESULTATS Paramètres performance de la séquence codante Paramètres performance de la séquence codante signal dintensité total signal dintensité total détermination du gène « présent » ou « absent » détermination du gène « présent » ou « absent » calculés par algorithmes standard affymetrix calculés par algorithmes standard affymetrix résumés pour le profil de transcription dun échantillon de foie de chien (n = 4) résumés pour le profil de transcription dun échantillon de foie de chien (n = 4)

14 Sondages provenant de séquences de chien = expression en moyenne + grande que sondages provenant séquences humaines Sondages provenant de séquences de chien = expression en moyenne + grande que sondages provenant séquences humaines Tt signal dintensité = déterminant majeur appelé dans lattribution des gènes de détection Tt signal dintensité = déterminant majeur appelé dans lattribution des gènes de détection 1 augmentation des valeurs dintensités + de gènes dérivés du chien = appelés « présent » 1 augmentation des valeurs dintensités + de gènes dérivés du chien = appelés « présent » 28% sondages spécifiques au chien = « présent » 28% sondages spécifiques au chien = « présent » 8% de ceux humains 8% de ceux humains

15 Signal dintensité sondes dérivées canine>homme MAIS dépend région codante =analysée Signal dintensité sondes dérivées canine>homme MAIS dépend région codante =analysée Autres expériences : pour voir si stratégie : Autres expériences : pour voir si stratégie : séquences dérivées de lhomme dans modèle de séquences codante canines améliore lhybridation à travers les espèces séquences dérivées de lhomme dans modèle de séquences codante canines améliore lhybridation à travers les espèces Déterminer si source de faible intensité du signal humain = Déterminer si source de faible intensité du signal humain = - faible réaction inter espèce - faible réaction inter espèce ou ou - defficacité - defficacité échantillons identiques foie CN hybridés séquentiellement pour les modèles de séquences codants pour les chiens et lhomme U133A échantillons identiques foie CN hybridés séquentiellement pour les modèles de séquences codants pour les chiens et lhomme U133A

16 Sur les 8945 RefSeq dérivés séquentiels de la sonde humaine sur les modèle de séquences codants chez le chien : 965 transcriptions « présentes » sur au – 1type de modèle de séquences codante sur échantillon de foie 965 transcriptions « présentes » sur au – 1type de modèle de séquences codante sur échantillon de foie Sur ces 965 -> 10% « présents » sur les 2 types de modèle Sur ces 965 -> 10% « présents » sur les 2 types de modèle 32% uniquement CN 32% uniquement CN 58% uniquement homme U133A 58% uniquement homme U133A Haut % gènes détectés exclusivement sur base 3de la sonde du modèle U133A suggère : Haut % gènes détectés exclusivement sur base 3de la sonde du modèle U133A suggère : La localisation de la sonde = facteur important dans la détection des nucléotides du modèle La localisation de la sonde = facteur important dans la détection des nucléotides du modèle

17 Différentes expressions des gènes en réponses aux LPS Test de laptitude du modèle de la séquence codante canine a détecter lexpression des différents gènes Test de laptitude du modèle de la séquence codante canine a détecter lexpression des différents gènes CN Beagle traités doses non létales dendotoxines bactériennes CN Beagle traités doses non létales dendotoxines bactériennes mesure expression gène hépatique à 4H et 24H après ladministration de LPS mesure expression gène hépatique à 4H et 24H après ladministration de LPS

18 Nombre de transcription détectée = pas variable entre les 2 gpes Nombre de transcription détectée = pas variable entre les 2 gpes Mais gènes régulés négativement = 4h > 8h Mais gènes régulés négativement = 4h > 8h Evaluer lintensité de la réponse inflammatoire : Evaluer lintensité de la réponse inflammatoire : Observations clinique Observations clinique Composition sérique Composition sérique Paramètres hématologiques et histopathologiques Paramètres hématologiques et histopathologiques corrélation avec données de lexpression corrélation avec données de lexpression génique obtenue par modèle séquence codante génique obtenue par modèle séquence codante canine canine

19 Observations cliniques concordent avec lévolution d1 endotoxémie : Observations cliniques concordent avec lévolution d1 endotoxémie : activité et vomissement activité et vomissement prise nourriture ( 24H) prise nourriture ( 24H) Effets hématologiques du médiateur LPS mesuré : Effets hématologiques du médiateur LPS mesuré : Leucocyte à 2 et 4h mais à 24h Leucocyte à 2 et 4h mais à 24h Neutropénie modérée à 2 et 4h Neutropénie modérée à 2 et 4h Neutrophilie modérée à 24h Neutrophilie modérée à 24h Légère prolongation activité partielle thromboplastine et prothrombine Légère prolongation activité partielle thromboplastine et prothrombine minime réticulocyte 2 h après administration minime réticulocyte 2 h après administration

20 Changements morphologiques : Changements morphologiques : congestion congestion nécrose nécrose vacuolisation des cellules hépatiques vacuolisation des cellules hépatiques Dans littérature, administration LPS cause: Dans littérature, administration LPS cause: Changements majeurs niveau marqueurs chimiques de réponse aigue de linflammation Changements majeurs niveau marqueurs chimiques de réponse aigue de linflammation [CRP] de 4 à 24h [CRP] de 4 à 24h Activité ALT et AST relativement Activité ALT et AST relativement disponibilité séquences ADN des marqueurs SAA, ALP, Albumine et AST ont permis comparaison changements chimiques avec donnée expression géniques des séquences codantes disponibilité séquences ADN des marqueurs SAA, ALP, Albumine et AST ont permis comparaison changements chimiques avec donnée expression géniques des séquences codantes

21 Détermination sériques de ces 4 protéines [SAA] pendant 2h après administration LPS + [SAA] pendant 2h après administration LPS + continue toute la période détude continue toute la période détude ARNm SAA = suractivé dans foie à 4 et 24h ARNm SAA = suractivé dans foie à 4 et 24h transcription induite + de 100 * dans gpes 4 et 24h transcription induite + de 100 * dans gpes 4 et 24h activité ALP tout au long de létude activité ALP tout au long de létude expression ARNm ALP à 4 et 24h expression ARNm ALP à 4 et 24h [albumine sérique] de 15% (point 24h) [albumine sérique] de 15% (point 24h) niveau transcrition ambumine de 4 * à 24h niveau transcrition ambumine de 4 * à 24h Activité sérique AST gpe 4h après administation Activité sérique AST gpe 4h après administation transcription hépatique séquence AST de 2* à 4 et 24h transcription hépatique séquence AST de 2* à 4 et 24h

22 Différents gènes exprimés sont choisis pour confirmation par PCR en temps réel PCR RT pour SAA, IL-8, TIMP1, NDS et SDF2L1 PCR RT pour SAA, IL-8, TIMP1, NDS et SDF2L1 confirmation résultats des modèles des régions codantes confirmation résultats des modèles des régions codantes induction SAA confirmée : gpe 4 et 24h induction SAA confirmée : gpe 4 et 24h rapide et brute induction IL-8 et TIMP1 confirmée par PCR rapide et brute induction IL-8 et TIMP1 confirmée par PCR Activité de régulation de ND5 détectée par sondes et PCR Activité de régulation de ND5 détectée par sondes et PCR SDF2L1 transcrit avec faible intensité SDF2L1 transcrit avec faible intensité corrélé avec résultats modèle de séquences codantes, PCR corrélé avec résultats modèle de séquences codantes, PCR confirme : confirme : primeur pour homme SDF2L1< pour lamplification que primeur du chien

23 Corrélation biologique et implication des résultats aux mesures transcriptionnelles Expression gènes combinés = exprimés tôt Expression gènes combinés = exprimés tôt + tard = réponses transcriptionelles aux endotoxines des bactéries + tard = réponses transcriptionelles aux endotoxines des bactéries Induction importante dans la transcription codant les cytokines et dautres médiateurs de linflammation = sobserve 4h post admi LPS Induction importante dans la transcription codant les cytokines et dautres médiateurs de linflammation = sobserve 4h post admi LPS IL-6 induit+++ à 4h puis basal à 24h IL-6 induit+++ à 4h puis basal à 24h IL-8 transcription à 4h, 20*> au gpe contrôle IL-8 transcription à 4h, 20*> au gpe contrôle

24 rapide et marquée transcription remodelage matrice extracellulaire tel TIMP1 rapide et marquée transcription remodelage matrice extracellulaire tel TIMP1 temps dépendante de protéines additionnelles de la matrice extracellulaire comme Elafine et IHRP temps dépendante de protéines additionnelles de la matrice extracellulaire comme Elafine et IHRP taux de glucose plasmatique taux de glucose plasmatique sous régulation transcriptions impliquées dans la régulation de glucose ( surtt 24h) sous régulation transcriptions impliquées dans la régulation de glucose ( surtt 24h) Ex gènes répressés : UDP gluc phosphorylase Ex gènes répressés : UDP gluc phosphorylase transporteur glucose type5 transporteur glucose type5 phosphoglucomutase phosphoglucomutase

25 Famille cytP450 = sous régulés à 24h Famille cytP450 = sous régulés à 24h Changement de transcription similaires dans la phase 2 de la biotransformation enzymatique (incluant plusieurs GST et UDP glucuro) Changement de transcription similaires dans la phase 2 de la biotransformation enzymatique (incluant plusieurs GST et UDP glucuro) taux cholestérols et triglycérides à 8 et 24h taux cholestérols et triglycérides à 8 et 24h massive expression gène codant pour enzymes impliquées dans métobo cholestérols observé à 24h massive expression gène codant pour enzymes impliquées dans métobo cholestérols observé à 24h Ex : ACAT, LCAT, CYP7A 7*à 24h mais pas à 4h Ex : ACAT, LCAT, CYP7A 7*à 24h mais pas à 4h

26 Implication des réponses transcrites mesurées : Modifications au niveau de la matrice extra cellulaire: Modifications au niveau de la matrice extra cellulaire: TIMP1 : augmente 4h et 24h post administration LPS MMP9 : augmente 24h post administration LPS Contrôle du remodelage de la MEC via équilibre entre le taux de métalloprotéinases activées et le taux de TIMPs. ( formation de complexes irréversibles ) ETAFIN : augmente post administration LPS inhibiteur sérique du gène de la famille des Troppines Contrôle protéolyse MEC via linhibition de lelastase DISCUSSION

27 IHRP : protéine de linflammation augmente post administration LPS ( expression du gène IHPR inductible par LPS ) L activité des enzymes extra-cellulaires des chiens traités au LPS serait donc liée au contrôle de la protéolyse des constituants de la MEC et préserverait ainsi lintégrité des tissus. NB: Une autre hypothèse explicative serait une inhibition directe des enzymes extra-cellulaires. TIMP1,ELAFIN et IHRP: marqueurs non invasifs de la phase aigue de la r é ponse inflammatoire ( dans sang et ARNm ).

28 Modification au niveau des médiateurs de linflammation : Modification au niveau des médiateurs de linflammation : Chez lhomme : 1- phase symptomatique à 4 h 2- phase asymptomatique à 24 h 2- phase asymptomatique à 24 h Chez le chien: 1- inflammation précoce 1- inflammation précoce 2- modifications voies métaboliques plus tardivement 2- modifications voies métaboliques plus tardivement Dans la littérature: Les LPS induisent une situation dendotoxémie responsable d une augmentation de lexpression des médiateurs de linflammation.

29 Détection de linduction de cytokines pro inflammatoires comme : IL 6, IL 8, TNF alpha capables dactiver des voies de signalements intra- cellulaires ainsi que dactiver des facteurs de transcription impliqués dans lactivation de gènes codant pr des molécules inflammatoires Modifications au niveau du métabolisme des lipides: Modifications au niveau du métabolisme des lipides: Suite à ladministration de LPS: perturbation du métabolisme lipidique au niveau du foie Diminution expression de gènes codant pr enzymes responsables du catabolisme du cholestérol et des triglycérides explique laugmentation tardive des taux sériques de cholestérol et TG

30 Modification au niveau du enzymes de la biotransformation: Modification au niveau du enzymes de la biotransformation: diminution expression et activité de certaines isoenzymes hépatiques lors phase aigue de linflammation observations en accord avec le fait que lexpression de certaines enzymes de la biotransformation diminue fortement suite administration de LPS Ex: niveau de transcription de CYP2D15 fortement à 24h post LPS diminution expression denzymes de la détoxification

31 Identification de nouveaux biomarqueurs de la phase aigue de l inflammation: activation du transcrit Sec61a: translocase de protéines impliquées dans la sécrétion protéique ( augmente à 4 h et à 24 h ) Sec 61 serait impliquée dans sécrétion des prot. de la phase aigue de linflam., synthétisées dans les hépatocytes et transportées dans le sang. La machinerie de translocation des prot. pourrait etre sensible à la [ ]° en cholestérol dans membrane du RE. SDF2L1: prot. sécrétoires fonctionnant comme enzymes O- glycosylantes dans levures. Lien entre phase aigue inflammation et état de glycosylation des protéines circulantes.

32 CONCLUSION Nombreux changements ( connus ou non ) au niveau de la transcription, dans le foie lors phase aigue inflam. Confirmation de ces résultats via paramètres comme: biochimie, hématologie, histopathologie et analyses PCR Génétique moléculaire: outil génial pour mieux comprendre les « mystères » des mécanismes inflammatoires. + découverte de nouveaux marqueurs de toxicité ainsi que de nouveaux gènes mis en jeu lors RI.

33 INTERETS pour développement industrie pharmaceutique en médecine humaine: tests des effets moléculaires chez le chien permettent meilleure prévision des effets chez lhomme évaluation toxicité éventuelle des médicaments à linverse, exploitation résultats obtenus chez lhomme à des fins thérapeutiques chez le chien. renforcement panel médical VT !!! Ne pas abuser des chiens comme animaux de laboratoire !!!

34 BIBLIOGRAPHIE Higgins, M.A. Berridge,B.R. Mills,B.J. Schultze,A.E. Gao, H. Searfoss,G.H. Baker,T.K.and Ryan,T.P (2003). Gene expression analysis of the acute phase response using a canine microarray Higgins, M.A. Berridge,B.R. Mills,B.J. Schultze,A.E. Gao, H. Searfoss,G.H. Baker,T.K.and Ryan,T.P (2003). Gene expression analysis of the acute phase response using a canine microarray Griffiths. Gelbart. Miller.Lewortin.(2001)Analyse génétique moderne. DeBoeck Université Griffiths. Gelbart. Miller.Lewortin.(2001)Analyse génétique moderne. DeBoeck Université


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