Plateforme d’analyse génétique

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1 Plateforme d’analyse génétique
Sara-Edith Penney, M.Sc. Coordonnatrice de la plateforme d’analyse génétique Centre de recherche de l’Hôpital Laval Local Y-3160 Téléphone: (418) poste 3761 Sous la supervision d’Éric Paradis

2 La plateforme d’analyse génétique (PAG)
Service de type utilisateur-payeur offert en priorité aux membres du Centre de recherche de l’Hôpital Laval. Service d’analyse génétique accompagné d’un support technique. Buts : Offrir un service personnalisé et adapté aux besoins de votre laboratoire. : Fournir des outils de travail utiles au quotidien et spécifiques à vos sujets de recherche.

3 Possibilités technologiques de la PAG
Biomek 2000 Dilutions en série Plaques qPCR et PCR Autres applications SpotArray Plaque array Purification de produits PCR Impression de micropuces CEQ-8000 Plaque séquençage Analyse de fragments (short tandem repeats) Séquençage (méthode Sanger) ScanArray Étapes d’extraction d’ARN Synthèse et marquage de l’ADNc Analyse et quantification du microarray

4 1er service PAG : séquençage d’ADN
* 1) Méthode de Sanger (1977) Incorporation de dNTP + faible proportion de ddNTP couplés à des fluorophores. 2) Électrophorèse capillaire Électro-injection des fragments d’ADN dans les capillaires. Migration selon la taille (en nt). Excitation des ddNTP marqués. Émission correspondant à la bonne base (A,T,C,G). De 500 bases à 700 bases selon la séquence

5 2è service PAG : microarray d’ADN (technologie «two colors»)
1. Conception et génération de la micropuce (ADN cible) 2. Préparation des sources d’ADNc à hybrider (sonde) 3. Hybridation de la micropuce 4. Analyse des résultats Mesure quantitative du niveau d’expression relatif de plusieurs gènes en une seule expérience.

6 Microarray : exemple d’application réalisé à la PAG
Expression comparative de gènes impliqués dans le diabète (Merci à Magalie Berthiaume et Yves Gélinas de l’équipe du Dr Deshaies!)                                                                                                                                        Objectifs Comparer le profil d’expression de certains gènes du foie impliqués dans le diabète chez le rat traité ou non avec du 11β-HSD1 inhibitor. Comparer les résultats obtenus en microarray avec ceux du qPCR pour ces gènes. Rat Sprague-Dawley *L’inhibiteur 11-HSD1 fonctionne in vivo de façon prédominante en réductase par la conversion du cortisone en cortisol.

7 Gènes d’intérêt Gènes dont l’expression est à étudier (à imprimer sur la micropuce) Gck : catalyse la phosphorylation du glucose. G6PDX : implication dans la pentose phosphate pathway. Acadvl : métabolisme des acides gras de la mitochondrie. Acadm : métabolisme des lipides. 5. Acox 1 : métabolisme des acides gras et PPAR signaling pathway. 6. MTP : assemblage des lipoprotéines riches en triglycérides.  au diabète. 7. Me 1 : catalyse la conversion du L-malate en CO2 et pyruvate. 8. ACS1 : «channeling» des acides gras via la synthèse lipides ou l’oxydation. 9. L-FABP : marqueur pour les blessures au niveau renal tubulointerstitiel.  au diabète. Structure moléculaire du 11β-HSD1 en complexe avec carbenoxolone et NADP+

8 Schéma expérimental : microarray
1. Conception et génération de la micropuce (ADN cible) Impression oligos 20-25mers (amorces de PCR) sur lame fonctionnalisée à l’epoxy silane. 2. Préparation des sources d’ADNc à hybrider (sonde) Contrôle : ARN foie, diète chow, marquage Traité : ARN foie, diète chow supplémentée 11β-HSD1 inhibitor (3 mg/kg/jour), marquage Cy3 Cy5 Intact 18S 28S Qualité de l’ARN des sondes 1 2 3 4 Contrôle Traité 3. Hybridation de la micropuce Combinaison 2 sondes marquées, hybridation. 4. Analyse des résultats Excitation par 2 lasers à 550nm et 625nm.

9 Changement d’expression des gènes après traitement ( à l’inhibiteur de 11b- HSD1) : qPCR vs microarray Rat traité #12 / Rat contrôle #2 1,779; 1,965; 1,943; 1,750; 1,624. 1,8122 +/- 0,1422 Étude en Microarray : «Spots considérés» : Cy3 et Cy5 signal to noise>2 et 2<0.05 : Changement d’expression non significatif si : Log2 (R/G) <0.5

10 Corrélation entre les résultats du qPCR et du microarray
Rat traité #12 / Rat contrôle #2

11 Particularités et avantages de l’utilisation du microarray
1) Analyse de l’expression de milliers de gènes simultanément (économie de temps et d’argent) 2) Rentabilisation des amorces ou des clones déjà existants 3) Micropuce personnalisée (analyse plus pertinente, spécialisation des micropuces pour les domaines de recherche) 4) Microarray «2-colors» (compatibilité avec plusieurs plateformes) 5) Haute qualité ARN pour les sondes 6) Importance majeure de la conception des oligos (le cas échéant) 7) Intégration de contrôles (positifs, négatifs, spiked RNA)

12 Possibilités du «Protein Array»
«Protein array» analytique (Zhu et Snyder, 2003) «Protein array» fontionnel (Zhu et Snyder, 2003) Impression d’une protéine purifiée à homogénéité (recoverine à 0,4mg/ml) sur lame epoxy silane

13 Exemple de «protein array» analytique
J Allergy Clin Immunol volume 118, number 1 (2006) Objectif Établir un système de «monitoring» simple pour l’inflammation des voies respiratoires Méthodologie Récupérer les EBC* (exhaled breath condensate) de patients sains et asthmatique Les comparer au moyen d’une micropuce de protéines Lien entre ces cytokines et PD200 (provocative dose of methacoline) *EBC : Méthode non invasive donc possibilités de plusieurs répétitions (Barnes et al., 2005) On y a déjà identifié plusieurs molécules inflammatoires.

14 Le microarray à la PAG c’est…
Dans l’immédiat : Microarray d’ADN À moyen terme : CpG island (UHN) ChIP-on-chip (interaction ADN-protéine) (Agilent) Protein array Innovations dans la communauté scientifique Lipidomic array (Dr Robinson à Stanford) Cell array (Dr Sabatini à Boston) Et bientôt des array dynamiques… «Run on» array (transcription) (UHN) Ribosome capture array (traduction) (UHN)

15 Domaines d’application de votre PAG
Biologie moléculaire Possibilités de support technique au niveau des manipulations qui touchent aux services de la PAG (e.g. Extraction et préparation de l’ARN) CEQ-8000 Séquençage d’ADN* (plasmides et produits PCR) Analyse de fragments** (STR) Support technique Voir le document pour les modalités *Le service de séquençage est offert à un prix compétitif (voir celui de l’Université Laval) **Le prix pour l’analyse de fragments varie selon l’analyse à faire. Il faut prévoir la synthèse d’une amorce modifiée par l’incorporation d’un fluorophore.

16 Domaines d’application de votre PAG (suite)
Fabrication de micropuces à ADN personnalisées (jusqu’à gènes) Impression oligo court (20-30mers) ou long (50mers), produit PCR ( pb) Diverses lames fonctionnalisées (epoxy, amino, poly-L-lysine, aldéhyde) Impression de protéines sur lame epoxy Support technique Voir le document pour les modalités SpotArray *14700 «spots» *diamètre 100µm *espacé de 250µm (centre-à-centre) ScanArray Analyse et quantification du microarray Transmission des résultats informative Support technique Voir le document pour les modalités

17 Merci et au plaisir de vous rencontrer pour discuter de ce que la plateforme d’analyse génétique peut vous apportez! Merci à Magalie Berthiaume et Yves Gélinas de l’équipe de Dr Yves Deshaies! Pour toutes les informations au sujet de la tarification, les méthodes et autre, veuillez communiquer avec moi: Sara-Edith Penney, responsable de la PAG du CRHL Pavillon d’Youville local Y3160 Téléphone: poste 3761 Télécopieur: Courriel:

18 Informations complémentaires

19 Paramètres à déterminer par l’utilisateur du service de microarray
Détermination du substrat (ce qui sera imprimé sur la micropuce) Oligos courts (20 à 30 mers) Oligos longs (50 à 70 mers) ADNc (nécessite au moins une amplification PCR ainsi que son séquençage) B) Détermination des deux sondes (ce qui sera comparé) ARNtotal (5 à 25µg) ou ARNm (~500ng) (provenant de deux sources différentes) A B Pour faire incorporation des amino allyl-dUTP durant la synthèse de l’ADNc puis marquage des AA-dUTP avec des CyDye NHS-ester.

20 Critères pour la conception des oligos
Longueur en nucléotides. On veut que tous les oligos ont la même longueur. Ils peuvent être courts (20-30nt) ou longs (50-70nt). Aucune dimérisation et aucune formation de structure secondaire. Tm uniformes entre les oligos. % (G+C) entre 40 et 60% de la séquence (Li et Stormo, 2001). Régions continues de A, T, C ou G, moins de 25% de la taille de l’oligo (Li et Stormo, 2001). Pour oligos de 50mers un maximum de 10 «mismatch» (Kane et al., 2000). Énergie libre. On veut un minimum d’énergie libre (G) d’hybridation pour le gène d’intérêt et le maximum G avec les autres gènes. Plus le G est élevé, plus l’oligo est instable (Li et Stromo, 2001).

21 Détails de l’appareillage de la PAG

22 Appareillage de la plateforme d’analyse génétique
Station de séquençage d’ADN CEQ-8000 (Beckman-Coulter) Spécifications techniques : Huit (8) capillaires Un système d’électrophorèse 2 lasers Une caméra CCD Utilisation de la méthode de Sanger (dNTP terminator) (Sanger et al., 1977) Utilisation : - Séquençage d’ADN (plasmides et produits PCR) -Analyse de fragments, génotypage.

23 Appareillage de la plateforme d’analyse génétique (suite)
Station de fabrication de micropuces SpotArray24 (Perkin-Elmer) Spécifications techniques : 24 places pour des lames fonctionnalisées à imprimer Un système de contrôle de l’humidité et de la température Utilisation : - Impression d’ADN sur des lames fonctionnalisées

24 Appareillage de la plateforme d’analyse génétique (suite)
Station d’analyse de micropuces ScanArray Express (Perkin-Elmer) Spécifications techniques : Une protection contre la lumière Deux lasers (λ de 633µm et 543µm) Un logiciel de quantification des «spots» Utilisation : - Analyser de l’expression différentielle des gènes présents sur la micropuce.

25 Appareillage de la plateforme d’analyse génétique (suite)
Station de pipettage automatisée Biomek 2000 (Beckman-Coulter) Spécifications techniques : Plusieurs outils de pipettage (multiple et différents volumes) Adaptateur pour microtubes Unité de vacuum Unité de lavage Et bien d’autres… Utilisation : Automatisation d’une partie des manipulations Accélérer et uniformiser les manipulations.

26 Détails du séquençage à électrophorèse capillaire

27 Séquençage d’ADN : méthode Sanger
L’ADN soumis au séquençage doit d’abord être amplifié par une polymérase qui incorpore des dNTPs en plus d’une faible proportion de ddNTPs marqués, ces derniers mettant fin aléatoirement à l’élongation. Il s’agit de la méthode de Sanger (Sanger et al., 1977). L’ADN ainsi amplifié est électro-injecté dans le système d’électrophorèse capillaire où il y aura migration des fragments d’ADN selon leur longueur, dans une matrice de gel de polyacrylamide, sous l’effet d’un très haut voltage. À l’autre extrémité du capillaire (l’anode), un laser excite les ddNTPs marqués qui émettent de la fluorescence à une longueur d’onde spécifique qui correspond à une base spécifique.

28 Effet EOF : electroosmosis or electroosmotic flow
Sous l’effet du champ électrique ADN de charge nette (-) migre vers l’anode dans un électrolyte, souvent polyacrylamide. Cependant l’EOF peut affecter négativement la séparation. Pour remédier à cela, l’intérieur des capillaires à été enduit d’un polymère inerte.

29 Détails divers sur le microarray

30 Analyse des microarray
Box plot Heatmap : diff. de couleur=expression relative MA plot pvalue Volcano plot

31 Analyse des microarray : légende de la diapositive précédente

32 Microarray : technologie Affymetrix
Photolithographie 1. Conception et génération de la micropuce (ADN cible) Photolithographie: - densité de l’ADN; - Maximum de 25nt par séquence; - 11 à 20 paires de séquences par gène. 2. Préparation des sources d’ADNc à hybrider (sonde) Marquage des ARNc à la biotine. 3. Hybridation de la micropuce 1 ARN pour 1 micropuce 4. Analyse des résultats - Révélation avec streptavidine/phycoérythrine - Criblage à 488nm (émission à 570nm)