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Biologie Moléculaire des cancers et applications thérapeutiques Pr. C A Cuénod HEGP / LRI Necker

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Présentation au sujet: "Biologie Moléculaire des cancers et applications thérapeutiques Pr. C A Cuénod HEGP / LRI Necker"— Transcription de la présentation:

1 Biologie Moléculaire des cancers et applications thérapeutiques Pr. C A Cuénod HEGP / LRI Necker

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7 Hypothèse de travail en cancérologie moléculaire Si nous comprenons les mécanismes responsables dun type spécifique de cancer, nous aurons une approche rationnelle pour Si nous comprenons les mécanismes responsables dun type spécifique de cancer, nous aurons une approche rationnelle pour la prévention, le diagnostic précoce, le développement de nouveaux traitements. Gadzar PNAS Aout 2001

8 Facteurs des progrès Pendant les 30 dernières années nos connaissances sur la pathologie moléculaire des cancers ont progressé grâce : Human genome project Human genome project Banques de tissus Banques de tissus Lignées cellulaires Lignées cellulaires Kits de biologie moléculaire Kits de biologie moléculaire

9 DNA Microarrays Spotted cDNA slides 1. Prepare a gene chip using all 6,200 yeast genes by PCR. 2. Spot the denatured DNA onto slides. 3. Prepare mRNA from two populations of cells. 4. Convert the mRNA into cDNA using nucleotides labeled with Cy3 (green for control) or Cy5 (red for experimental) 5. Mix the labeled cDNAs and hybridize to tethered gene cDNAs on chip. 6. Wash and read the intensities of the spots with a laser. 7. Analyze the data.

10 ……… ……… ……… ……… ……… ……… ……… Normal tissueCancer Extract RNA Synthesize cDNA copy with dUTP Cy 3 Synthesize cDNA copy with dUTP Cy 5 Mix and hybridize

11 ……… ……… ……… ……… ……… ……… ……… Scanning and Data Extraction

12 Green = expression higher in normal tissue Red = expression higher in cancer tissue Yellow = same expression Iyer, et al. Science 283:83, 1999

13 Tumor stem-cell TUMOR FORMATION Differentiation Death Neoplastic Transformation Proliferation Cell Death

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15 Tumeurs -Tumeurs Malignes = Cancer 1 - Croissance rapide 2 - Agressives (envahissement local) 3 - Récidives locales 4 - Métastases à distance 5 - Evolution fatale -Tumeurs Bénignes

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17 Conséquences des modifications moléculaires des cellules tumorales 1 Autosuffisance en signaux de croissance 1 Autosuffisance en signaux de croissance 2 Résistance aux signaux anticroissance 2 Résistance aux signaux anticroissance 3 Incapacité à réparer lADN - Instabilité génétique 3 Incapacité à réparer lADN - Instabilité génétique 4 Diminution de la sensibilité à lapoptose 4 Diminution de la sensibilité à lapoptose 5 Réplication illimitée (immortalité) 5 Réplication illimitée (immortalité) 6 Néoangiogénèse 6 Néoangiogénèse 7 Perte de dépendance à ladhésion- adhésion altérée 7 Perte de dépendance à ladhésion- adhésion altérée 8 Invasion tissulaire et métastases 8 Invasion tissulaire et métastases

18 Facteurs de carcinogénèse Oncogènes: - récepteurs de croisance : erb-B2 - inhibiteurs des protéines inhibitrices - facteurs de transcription - voie de signalisation : Ras Défaut des gènes suppresseurs - régulateurs du cycle cellulaire : RB, p53 - molécules dadhésion cellulaire : cadherine-E, C-CAM - inhibiteurs des protéines oncogènes : mxel Incapacité à réparer ou défendre lADN - réparation inefficace : MSH2, MLH1 - stress oxydatif : GSTP1 Echappement à la mort cellulaire - absence dapoptose : Bcl2, Bclx, p53 - Potentialité de réplication illimitée : télomérases Néoangiogénèse Altération de ladhésion Invasion tissulaire et métastases

19 Causes de carcinogénèse DélétionMutationSur-amplification Modification des méthylations

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21 Horloge du cycle cellulaire Assemblage de protéines qui interagissent au sein du noyau, exécutant les messages transmis par les voies de stimulation et dinhibition.

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23 La voie de signalisation Libération de facteurs de croissance dans le milieu intercellulaire Liaison à des récepteurs membranaires Transmission dun signal jusquau noyau par des protéines du cytoplasme Les facteurs de transcription activent les gènes qui déclenchent/bloquent le cycle de la croissance cellulaire.

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30 Deux classes de gènes ont un rôle essentiel dans lapparition de cancer Les proto-oncogènes stimulent la croissance, Les gènes suppresseurs de tumeurs linhibent. En cas de mutations de ces gènes, une prolifération cellulaire incontrôlée est à lorigine de cancer.

31 1) Autosuffisance en signaux de croissance : rôle des Oncogènes surproduction de facteur de croissance. quantités excessives de facteur de croissance des plaquettes (PDGF), TGF alpha. récepteurs anormaux qui émettent en continu de signaux de prolifération même en labsence de facteur de croissance. Erb-B2 perturbent la cascade des signaux cytoplasmiques. Les protéines codées par des gènes ras mutés perturbent lactivité des facteurs de transcription dans le noyau. famille myc produisent des facteurs de transcription Myc

32 Anomalies des récepteurs HER2 Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 amplification du gène, avec formation de nombreuses copies et surproduction de la protéine HER2 20 % des cancers du sein. mauvais pronostic, HER1 ou REGF Epidermal Growth Factor Receptor

33 Oncogènes de la famille RAS (1) Mutation présentes dans 25 % des cancers Activation de RAS entraîne une prolifération cellulaire Famille d oncogènes : H, N et K-RAS

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35 La maturation de la protéine Ras Les protéines RAS doivent être modifiées par des farnésylations La localisation membranaire nécessite une méthylation de RAS

36 Protéines Kinases En aval de la signalisation par Ras, des protéines kinases sont activées, notamment - RAF protéine activée par le MAP, - ERK Kinase (MEK) - MAP kinase.

37 PI3 et Akt Ras active aussi une phosphatidylinositol 3 kinase (PI3 Kinase) qui elle même active la protéine kinase Akt (qui est un suppresseur de lapoptose)

38 Receptor dimerization HER2 HER3 38

39 phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K);

40 Phosphorylation of the receptor tyrosine kinase domain PP 40

41 Recruitment of adaptor proteins Shc Grb 2 Sos PI3K PP 41

42 Initiation of signaling pathways P P Shc Grb 2 Sos PI3K Ras AKT P Raf 42 MAPKK

43 Cytoplasmic signaling cascades MAPK P GSK-3 P P Shc Grb 2 Sos PI3K Ras AKT P Raf 43 MAPKK

44 Relaying the message to the nucleus P P Shc Grb 2 Sos PI3K P Ras Raf AKT GSK-3 P P MAPK 44 MAPKK

45 Activation of target genes P P Shc Grb 2 Sos PI3K P Ras Raf MAPK AKT GSK-3 P P Gene transcription 45 MAPKK

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48 Stratégies thérapeutiques Le trastuzumab (Herceptin) AC contre HER2 (proposé si score 2+) REGF inhibés par des inhibiteurs (Iressa) ou par des AC monoclonaux (Cetuximab) Farnésyltransférase inhibée pour ne pas produire de pRas mature (FTI ou Zarnestra) Antisens: un petit fragment dADN ou dARN inhibent les ARNm et bloquer la synthèse des protéines-kinases. LImatinib mesylate (Glivec) dirigée contre la protéine tyrosine- kinase produite par le BCR ABL des LMC, aussi active sur la protéine KIT et sur le récepteur du PDGF des Tum stromales.

49 Herceptin°(trastuzumab) : Ac nonoclonal « humanisé » à 95 % Se lie au domaine extracellulaire du récepteur HER-2 inhibe la prolifération des cellules sur-exprimant HER-2 The biotech company Genentech gained FDA approval for trastuzumab in Sept Genentech Trastuzumab costs about seventy thousand dollars for a full course of treatment.

50 2) Résistance aux signaux anticroissance : rôle des gènes suppresseurs de tumeurs Les gènes qui bloquent la formation de tumeur peuvent laisser se développer des cancers lorsquils sont modifiés. Les principaux suppresseurs de tumeurs sont les pRB et p53.

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52 Perturbation des voies de linhibition Le récepteur au facteur de croissance TGF-bêta peut devenir insensible Les protéines, en aval du récepteur, peuvent être absentes: p15, p16 et p21 (dont la fonction est dinterrompre la division cellulaire) pNF-1 qui inhibe la protéine Ras

53 Protéine RB De rétinoblastome Principal frein du cycle cellulaire RB activé ralentit la réplication de lADN En labsence de pRB, le facteur E2F provoque une prolifération anarchique des cellules

54 RB activé ralentit la réplication de lADN

55 En labsence de protéine RB, E2F provoque une prolifération anarchique des cellules

56 3) Incapacité à réparer lADN Sans les gènes de réparation, des mutations saccumulent: 10 à 20 % des K du colon présentent des mutations des gènes MLH1, MSH2, PMS1 et PMS2 Les protéines ATM et p53 suivent le cycle cellulaire et empêchent la cellule dentamer une étape si les étapes précédentes ne se sont pas déroulées normalement.

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58 4) Diminution de la sensibilité à lapoptose

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60 p53 P53 a deux rôle essentiels : bloquer la division cell. par lintermédiaire de p21 entraîner le suicide cellulaire (apoptose).

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66 5) Immortalité cellulaire La durée de vie des cellules est contrôlée par une horloge moléculaire qui les fait entrer en sénescence après un nombre limité de divisions. Une ADN polymérase, la télomérase, est capable de réparer les télomères, « immortalisant » ainsi les cellules.

67 Perte dun télomère à chaque réplication

68 6) Néo-angiogénèse Cf cours ultérieur

69 7) Altération de ladhésion

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74 8) Invasion tissulaire et métastases Les cellules métastatiques présentent : des modifications du cytosquelette, une perte dadhésion, Une perte de la polarité une mobilité accrue, elles expriment des enzymes protéolytiques de la membrane basale.

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77 Tumor Basement Membrane Extracellular Matrix Basement Membrane Adhesion to and Invasion of Basement Membrane Intravasation Adherence to Basement Membrane and Extravasation Metastasis Hematogenous Metastasis

78 Sites métastatiques

79 Les cellules tumorales circulantes utilisent des récepteurs pour se fixer à la fibronectine de la matrice extracellulaire

80 Des fragments de RGD bloquent les récepteurs que la cellule tumorale circulante utilise pour se fixer à la fibronectine de la matrice extracellulaire

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85 Non-antigenic Non-proliferative Growth Factor Independent Autocrine Growth-loop Metastatic Tumor stem-cell TUMOR CELL HETEROGENEITY

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87 L étude des cellules au stade pré-néoplasique Peut permettre : –Didentifier des individus à risque –De prévenir l apparition de cancers

88 Lavenir est aux traitements «sur mesure» Loncologie moléculaire devrait permettre de caractériser le profil génétique de chaque tumeur et de développer un ciblage moléculaire de médicaments. Le rôle de limagerie, quelle soit fonctionnelle ou moléculaire, sera essentiel dans ces stratégies de prise en charge.

89 Rôle de limagerie Surveillance des patients à risque, Localisation des lésions, Prélèvements transcutanés, Ciblage spécifique (diagnostique), Suivi-évaluation de lefficacité, Ciblage spécifique (thérapeutique), Injections in situ …

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99 Drug Target Clusterings Reveal Clues To Mechanism Nature Genetics 24: 236, 2000; 5FU/DPYD L-Asparaginase /ASNS

100 C. ER PR etc Cyclin D Hsp 90 pAKT EIF2 kinase raf erbB2 EGFR lck, met, etc G 0 telomerase B. nucleus * hsp 90 * hsp 90 * hsp 90 A. X degradation nucleus X hsp 90 Immature X Mature X ER folding X -mRNA X Hsp 90

101 Three Dimensional View Of Geldanamycin Binding Pocket In Amino Terminus Of Hsp90 Stebbins et al, Cell 89:239, 1997

102 Challenges In Pursuing The Molecular Therapeutics Of Cancer Must change thinking from histologic to molecular diagnoses (CGAP, array technology) Develop new means (imaging, probes) to assess molecular pharmacodynamics Must move away from cytotoxicity as sole primary endpoint: assess and evaluate cytostatic effect Promote patient participation in clinical trials Develop speed and efficiency in answering critical clinical questions

103 Goals For Cancer Drug Screening In The New Millennium Associate novel chemotypes with defined targets may utilize purified targets at the front end may define targets in pathway/organisms may retrofit molecules to targets or pathways by statistical approaches Allows facile tools for chemical/pharmacological optimization Define targets of relevance to and translatable in early clinical trials

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105 Lapatinib GSK reporte à la fin 2006 ou au début 2007 le dépôt de la demande d'autorisation de son anticancéreux lapatinib, molécule candidate au traitement du cancer avancé du sein. Les résultats présentés au congrès de l'American Society of Clinical Oncology (ASCO) montrent que 35 % des 40 femmes incluses dans l'essai répondent au traitement en première intention. Celles-ci ont vu une réduction d'au moins 30 % de leur tumeur et un autre tiers a enregistré une stabilisation de leur cancer.

106 TYKERB: Lapatinib Nouvel inhibiteur de la tyrosine kinase dirigé à la fois contre: - le récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2) - le récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2) - le récepteur 1 de ce même facteur de croissance (EGFR). - le récepteur 1 de ce même facteur de croissance (EGFR).

107 HER2/neu ErbB-2 EGFR2 Cell membrane surface-bound tyrosine kinase and is involved in the signal transduction pathways leading to cell growth and differentiation. tyrosine kinase signal transduction tyrosine kinase signal transduction HER2 is a proto-oncogene located on chromosome % of breast cancers have an amplification of the HER2/neu gene or overexpression of its protein product, associated with increased disease recurrence and worse prognosis. Because of its prognostic role as well as its ability to predict response to trastuzumab, breast tumors are routinely checked for overexpression of HER2/neu. trastuzumab Overexpression also occurs in other cancer such as ovarian cancer and stomach cancer.

108 HER2/neu ErbB2 The oncogene neu is so-named because it was derived from a neuroglioblastoma cell line in rat. oncogene HER2 is named because it has similar structure to human epidermal growth factor receptor, or HER. epidermal growth factor receptor epidermal growth factor receptor ErbB2 was named for its similarity to ErbB (avian erythroblastosis oncogene B), the oncogene later found to code for EGFR. Gene cloning showed that neu, HER2, and ErbB2 were the same.

109 Thérapeutique ciblée Lexemple du Sorafenib (BAYER) Jacques DUMAS

110 EGF L a cascade Ras/Raf/MEK/ERK Prolifération cellulaire MEK P ERK1/2 P Translocation Ras Grb2 P Raf P Sos

111 R af kinase : approche par screening Collaboration avec Onyx Pharmaceuticals Banque de composés testée 88 molecules identifiées (> 50% dinhibition à 10 µM) GK00687 sélectionné pour la suite de lévaluation Potentiel pour la synthèse en parallèle GK00687 c-Raf IC 50 = 17 µM p 38 2 IC 50 = 260 nM S OMe O H N H N O

112 L ead inhibiteur de c-Raf GK00687 c-Raf IC 50 = 17 µM Amides moins actifs Peut être furane ou pyrrole tert-Bu le plus actif Potentiel SAR limité Urée requise pour lactivité S OMe O H N H N O S OMe O H N H N O CH 3 c-Raf IC 50 = 1,7 µM

113 N H N H O S COOCH 3 C himie combinatoire

114 N H N H O S COOCH 3 C himie combinatoire

115 Synthèse de 1000 composés en parallèle N O H N H N O O c-Raf = 1,1 µM

116 N O H N H N O O Optimisation menant au sorafenib H N CF 3 H N Cl O N O H N O CH 3 O N H N O CH 3 CH 3 N H N O O H N O H N Cl CF 3 Sorafenib (BAY ) c-Raf = 12 nM

117 ATP Boucle dactivation B-Raf cristallisé avec ATP (Barford et al., Cell 2004, 116, 855)

118 Sorafenib

119 P rofil anti-kinase du sorafenib c-Raf (protéine complète)6 nM b-Raf (wild-type)22 nM b-Raf (V600E)38 nM p nM VEGFR-290 nM VEGFR-310 nM mVEGFR-26 nM mPDGFR-28 nM FLT-358 nM c-Kit48 nM FGFR-1580 nM EGFR, HER-2, c-Met,> 10,000 nM IGFR-1, PKA, AKT, cdk-1, pim-1, GSK-3, CK-2, PKC, PKC, PKC, MEK, ERK-1 Wilhelm et al., Cancer Res. 2004, 64, CF 3 Cl N H N H O O N N H O Sorafenib

120 L 'accumulation du 18 FDG au niveau des tumeurs est liée à de multiples facteurs Prolifération Oncogenèse : phénomène complexe InvasionAngiogenèse Apoptose Niveau de prolifération cellulaire Hypoxie Vascularisation Viabilité cellule Cellules du granulome inflammatoire

121 Nexavar inhibiteur multikinase : anti-prolifératif et anti-angiogénique (Sorafenib Bayer) Cellules endotheliales PLC PI3K RAS RAF MEK ERK Nexavar ® VEGF Noyau Nexavar ® VEGF = vascular endothelial growth factor PI3K = phosphoinositide-3 kinase PLC = phospholipase C Nexavar ® inhibe la prolifération et/ou la survie dans les cellules endothéliales


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