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Fabian GROSS Chef de projet Biothérapies CIC BT/DRI CHU de Toulouse.

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1 Fabian GROSS Chef de projet Biothérapies CIC BT/DRI CHU de Toulouse

2 Laboratoire de recherche et promoteur Approches in vitro et in vivo relevant de la pathologie visée par le protocole clinique. Développement du « médicament expérimental » Laboratoire de recherche Intérêt d’une cible ou d’une approche expérimentale (in vitro et in vivo) Développement d’un médicament

3 Etudes Pré Cliniques : le contexte Etudes Pharmacologiques : activité du produit Etudes Pharmacocinétiques : devenir et intéractions du médicament dans l’organisme (homme ou animal) Etudes Toxicologiques : effets adverses d’un produit Toxicité aigüe Toxicologie chronique Toxicologie de la fonction de reproduction Etudes de mutagénèse Etudes de cancérogénèse Déterminent la valeur thérapeutique et les investigations chez l’homme (paramètres cliniques à surveiller)

4 Etudes Pré cliniques : Stratégie Adoptée Principales lignes directives : International Conference of Harmonization Nature des études selon le stade de développement du produit : ICH M3 (CPMP/ICH/286/95) Produits biotechnologiques: ICH S6 (CPMP/ICH/302/95) Application: Thérapie anticancéreuse : ICH S9 (CPMP/SWP/997/96) Préambule : - Produit ou Médicament identique ou comparable a celui de l’essai clinique -Méthodes et techniques validées (in vitro et in vivo)

5 Dossier de Pharmacologie Etudes pharmacologiques Pharmacodynamie Données in vivo et in vitro de l’activité du produit liée ou non a l’effet thérapeutique attendu Pharmacologie de sécurité Effets sur système respiratoire, nerveux et cardiovasculaire => voir études de toxicologie Etudes pharmacocinétiques Données sur l’absorption, le métabolisme, la distribution, la fixation des protéines plasmatiques, l’excrétion et le bilan de radioactivité Si étude in vitro => matériel d’origine humaine

6 La toxicologie conditionne la première dose à administrer à l’homme Seuil d’efficacité MABEL ( Minimal Anticipated Biological Effect Level ) Seuil de tolérance Aucun effet : pharmacologique (NOEL : No Effect Level) Secondaire (NOAEL : No Adverse Effect Level) Dose Maximale Tolérée MTD

7 Toxicologie Générale Objectifs : Détermination de la 1 ère dose injectée à l’homme (Phase 1) Identification des effets adverses et d’organes cibles (NOEL et NOAEL) Reversibilité des effets adverses Relation effets du produit et de ses métabolites Influence du sexe, de la dose, du temps d’exposition ou d’autres facteurs Design : Groupes : Control (véhicule seul), faible dose (NOEL), forte dose (MTD) et dose moyenne Animaux : 2 espèces (un non rongeur), ♂ et ♀ Durée : 24h à 2 ans Voie et régime administration : IV et voie clinique envisagée Etudes BPL (directives 2004/10/CE et guidelines applicables EMEA Guideline EMEA/CHMP/410869/2006 du 31/07/2007)

8 Etude de Biodistribution et de Toxicité par administration unique Injection : IV puis voie clinique, suivi pendant 2 à 5 semaines Escalade de doses selon un processus séquentiel Suivi : Observations cliniques sur les 1 ères 24h puis 1 à 2 fois par semaine Analyses biologiques et biochimiques Sacrifice et Autopsie : Examens anatomo-pathologiques d’une 12 aine d’organes Etude du potentiel immunotoxique Dosage du médicament expérimental ou des cellules dans les organes

9 Exemple du CYL-02 Injection IV du CYL-02 (1 er lot pré-GMP) chez la souris de 250µg/kg à 7500µg/kg Suivi : Observations cliniques et analyses bio et bioch (sang, urine) Autopsie : Examens anatomo-pathologiques de 12 organes + tumeur Dosage du transgène (organes, sang et urines) Définition de la NOAEL à 1500µg/kg

10 Répartition de la positivité sexe/organes/doses confondus Biodistribution : Poumon, foie, rein, muscle et gonades Quantification des transgènes par qPCR Pic de détection à 6h post injection

11 Toxicité et biodistribution par voie « clinique » Conduit sur un 2 ème modèle animal OBJECTIFS Calculer la première dose à administrer à l’homme suivant le mode d’administration prévu en clinique METHODES Modèle animal pathologie ou du modèle d’étude si non disponible Injection du ME par la voie clinique, suivi des animaux sur les jours suivant et 1 à 2 fois par semaines (biologie et biochimie). Traitement de l’animal par les traitements concomitants de l’étude Entre 2 et 5 semaines, sacrifice des animaux et prélèvement des organes pour anapath et dosage du médicament expérimental

12 Toxicité intratumorale du CYL-02 Toxicité intratumorale du CYL-02 J0 queue du pancréas par mini- laparotomie gauche (allogreffe orthotopique) J7 Contrôle de l’évolution de la tumeur par laparotomie médiane exploratrice. Injection et suivi des animaux. J9, 11 et 13 Injections intrapéritonéales de Gemcitabine (80 mg/kg). J15 Sacrifice des animaux et prélèvement des organes. 4 groupes : Glucosé 5% (véhicule) avec ou sans traitement Gemcitabine CYL-02 (900µg/kg) avec ou sans traitement Gemcitabine Aucune létalité dans l’ensemble des groupes ayant reçu le CYL-02 seul ou associé à la gemcitabine.

13 Résultats de la biodistribution après injection intra tumorale CYL-02+ NaCl CYL-02 + Gemcitabine Tumeur+++++ Rate+/-+ Foie+++++ Rein et intestins-+/- Poumons, muscles et gonades -- Biodistribution : Présence du transgène dans la tumeur 8 jours après une injection intra-tumorale. « CYL-02 + gemcitabine », faible positivité au niveau rénale et intestinal alors que positif au niveau splénique Suivi pondéral : Aucune anomalie pondérale et clinique dans le groupe CYL-02, Amaigrissement significatif (15% en moyenne) avec la gemcitabine, Aucune différence significative entre « gemcitabine seule » versus « CYL-02 + gemcitabine». Examen anatomopathologique macroscopique : Aucune lésion pancréatique, péritonéale, ou hépatique Témoinsgemzar PTG PTG + gemzar % de progression - 50 ± 3 %

14 OBJECTIFS Simulation du protocole proposé chez l’homme Accumulation Sensibilisation Cerner la Pharmacologie de Sécurité Calculer la première dose à administrer à l’homme Etude de Toxicité à dose répétée du Cyl-02 Calcul de la 1 ère dose injectable à l’homme HED (Dose équivalente chez l’Homme) = NOAEL (Animal)/ Facteur de sécurité/ fact clearance (Homme/Animal) Soit : 900µg/Kg/60/7,4 = 2µg/kg Poids moyen d’un patient ACP de 63kg => 125µg

15  Injection de CSM dans l’organe considéré sur le modèle animal Nude de la pathologie visée par l’étude clinique sur des 10x ♂ et 10x ♀ : vehicule seul (CTRL –) et CSM  Surveillance des signes cliniques des animaux (poids, sociabilité) 1 à 2 x / semaine  Sacrifice à 3 semaines (toxicité aigüe) et 12 semaines (toxicité chronique), observation macroscopique sur 8 organes (ganglions, foie, cerveau, reins, rate, peau, gonades et poumons) + organe injecté  Résultat : Evolution du poids, morbidité, mortalité et signes de toxicité, anatomopathologie  Recherche de cellules humaines par qPCR (ALU) Exemple d’étude de biodistribution Aucune altération des organes Aucune cellule humaine à 3 et 12 semaines

16 Génotoxicité OBJECTIFS : Recherche de toute modification du matériel génétique induite par le ME Recherche d’une potentialité mutagène MODALITE : Etudes normalisées in vitro et in vivo, comprenant : 1.Test de mutation génique in vitro sur bactéries (test de Ames) 2.Test d’aberrations chromosomiques in vitro sur cellules de mammifères 3.Optionnel : Test d’aberration chromosomique in vivo sur cellules hématopoïétiques de rongeur (test du micro noyau) Thérapie Génique : Mutagénèse insertionnelle des vecteurs viraux Thérapie Cellulaire : Tumorigénicité des cultures cellulaires

17  Injection intramusculaire ou sous cutanée chez la souris Nude (5 animaux/grpe) de CSM : HT29 (CTRL+) ; véhicule seul (CTRL –) et CSM  Surveillance des signes cliniques des animaux (poids, sociabilité) 1 à 2 x / semaine  Mesure des nodules 1 a 2 fois par semaine pendant 12 semaines  Sacrifice à 90 J et observation macroscopique sur le site d’injection et 6 organes (en général : ganglions, foie, cerveau, reins, rate et poumons)  Si apparition de tumeurs, qPCR pour recherche de cellules humaines (ALU)  Résultats : Suivi des animaux, poids, anatomopathologie et volume des tumeurs Exemple d’étude de tumorogénicité Résorption au point d’injection en 3 à 6 jours Pas de développement de tumeur Aucune altération des organes à 90J

18 Promoteur Protocole clinique sur des volontaires (sains ou patients) suivant des modalités d’inclusion et de suivi prédéfinies Développement d’un médicament Laboratoire de recherche et promoteur Approches in vitro et in vivo relevant de la pathologie visée par le protocole clinique. Développement du « médicament expérimental » Laboratoire de recherche Intérêt d’une cible ou d’une approche expérimentale (in vitro et in vivo)

19 Documents spécifiques à la TG Documents spécifiques à la thérapie génique : Ces documents sont a fournir par le promoteur lors de la demande d’Autorisation d’Essais Clinique (AEC) faite à l’ANSM et au HCB en plus des documents communs. · CERFA n° 12536*02 : agrément des locaux de recherche clinique en fonction du classement de l’OGM établit par le HCB. Décret n° du 27 mars 1993 et arrêté du 27 décembre · Annexe 2 : Principes applicables a l’évaluation du risque pour l’environnement décrit en termes généraux l'objectif à atteindre, les éléments à prendre en considération et les principes généraux ainsi que la méthodologie à suivre pour effectuer l'évaluation des risques pour l'environnement. Directive 2001/18/CE du 12 mars · Annexe 3A : Informations devant figurer dans la notification concernant la dissémination des OGM autres que les plantes supérieurs. Directive 2001/18/CE du 12 mars · Formulaire de synthèse de la notification concernant la dissémination volontaire d’OGM dans l’environnement à d’autres fins que leur mise sur la marché. Directive 2001/18/CE du 12 mars · Fiche d’information destinée au Public présente les buts et les utilisations prévues de la dissémination, la description synthétique et les méthodes de surveillance. Cette fiche d'information permet de procéder à une consultation du public sur cette dissémination et doit donc préciser les modalités de cette consultation et la date limite de réponse de 30 jours après sa publication sur le site internet de l’ANSM. Directive 2001/18/CE du 12 mars Remarque : la fiche d’information destinée au Public est différente de la notice d’information aux patients et ne la remplace en aucun cas. Annexe 2 : Principes applicables a l’évaluation du risque pour l’environnement. Annexe 3A : Informations devant figurer dans la notification concernant la dissémination des OGM autres que les plantes supérieurs. Formulaire de synthèse de la notification concernant la dissémination volontaire d’OGM dans l’environnement à d’autres fins que leur mise sur la marché. Fiche d’information destinée au Public : date limite de réponse de 30 jours après sa publication sur le site internet de l’ANSM 1. Demande de classement initial et d’agrément CERFA 1674*02 Intégrer dans la demande l’utilisation pour essai clinique (addendum demande initiale) 2. Demande d’agrément des sites hospitaliers CERFA 12536*02 Confinement doit être en adéquation avec le classement de l’OGM. Une demande d’agrément d’utilisation confinée d’OGM par site (pharmacie, chambre hospitalière, laboratoire, local d’administration…). numéro de dossier identique à celui du classement établit initialement par le HCB.

20 Ponction de MO Circuit du médicament Prélèvement de TA Sérologies patient (HIV 1&2, HTLV 1&2, HBC et HCV, Syphilis) Autorisation du lieu de prélèvement (bloc opératoire, anesthésie et praticien) Cahier navette Autorisation de site

21 Ponction de MO Circuit du médicament Congélation ou Mise en culture Prélèvement de TA Autorisation de site Société spécialisée et autorisée Transport avec respect des T° (ambiant, froid ou congelé) et des délais Règlementation transport matières vivantes (directive européenne 2004/23/CE)

22 Expansion cellulaire ou transfert de gène Ponction de MO Circuit du médicament Congélation ou Mise en culture Prélèvement de TA Cellules : SA Autorisation de site Société spécialisée et autorisée Autorisation de production Etablissement autorisé (établissement pharmaceutique ou non, classement pour OGM) Contrôles in process (stérilité) Délivrance d’un certificat de conformité Libération, congélation de la SA

23 Expansion cellulaire ou transfert de gène Ponction de MO Circuit du médicament Libération, congélation de la SA Congélation ou Mise en culture Prélèvement de TA Cellules : SA Mise en forme SA = PF Autorisation de site Société spécialisée et autorisée Autorisation de production Préparation et dispensation pharmaceutique Préparation pharmaceutique, stockage, décongélation, mise en forme, dispensation +/- confinement (double ou triple emballage) Retour et destruction des UT, pb de l’inactivation des OGM : solides a autoclaver (20 mn à 121°C) liquides a neutraliser à la Javel (12h 2% final extemporané)

24 Expansion cellulaire ou transfert de gène Ponction de MO Circuit du médicament Libération, congélation de la SA Congélation ou Mise en culture Prélèvement de TA Cellules : SA Mise en forme SA = PF Autorisation de site Société spécialisée et autorisée Autorisation de production Préparation de type pharmaceutique Injection au volontaire

25 Conclusions Produit grade recherche : Preuve de concept et compréhension du mode d’action (Pharmacologie) Développement et validation des techniques : caractérisation, identité, activité et fonctionnalité Test in vivo : validation du modèle animal, efficacité et effets secondaires (pré toxicologie) Produit grade Pré-GMP : Pharmacologie essentiellement in vitro sinon a intégrer aux études de toxicologie in vivo Tumorogénicité des MTI de TC et TG ex vivo, mutagénèse insertionnelle en TG Biodistribution des vecteurs et des cellules Toxicologie des vecteurs ou du transgène Produit grade Clinique : Circuit du médicament : confinement, délivrance, stabilité courte Circuit du patient : prélèvement, injection, hospitalisation Suivi des patients : effets adverses, confinement, fluides biologiques, destruction

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