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Les propriétés cinétiques de l'aspartate transcarbamylase - jour 2 aspartate Carbamyl phosphate carbamyl aspartate ATCase.

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1 Les propriétés cinétiques de l'aspartate transcarbamylase - jour 2 aspartate Carbamyl phosphate carbamyl aspartate ATCase

2 BCM311 - rappel comportement embouts  boite vide  boîte moitié vide - retourner au buffet - remplir (gants) et mettre à l'endroit pour stérilisation ultérieure (ne pas remettre au buffet)

3 BCM311 - rappel comportement  remplir flacons laveurs  vider poubelles de table  enlever cuvettes des spectrophotomètres  ne pas laisser des cuvettes pleines sous la hotte  départs hâtifs - manipulations - ménage - vérification du cahier

4 Jour 1 - variabilité

5 Jour 1 - allostérie R 2 = 0,9933R 2 = 0,9893 R 2 = 0,9961 R 2 = 0,9997

6 Jour 1 - faibles préparations

7 ATCase - but  ATCase est une enzyme allostérique  1 ère semaine - préparation de l'enzyme - détermination de la dilution  étudier les propriétés cinétiques de aspartate transcarbamylase (ATCase) d'E. coli vitesse

8 Organigramme - semaine 2  effecteurs d’ATCase (séries A, B et C) Préparation d’ATCase de la première semaine Dosage d’ATCase sans effecteur (Série A) Dosage d’ATCase en présence de CTP (Série B) Dosage d’ATCase en présence d’ATP (Série C) Courbe standard de carbamyl aspartate

9 Organigramme - semaine 2  désensibilisation du site allostérique (A,D+E) Préparation d’ATCase de la première semaine Dosage d’ATCase sans effecteur (Série A) Dosage d’ATCase en présence de Hg (Série D) Dosage d’ATCase en présence de Hg + CTP (Série E)

10 Organigramme - semaine 2  effecteurs d’ATCase (séries A, B et C) Préparation d’ATCase de la première semaine Dosage d’ATCase sans effecteur (Série A) Dosage d’ATCase en présence de CTP (Série B) Dosage d’ATCase en présence d’ATP (Série C) Courbe standard de carbamyl aspartate

11  CTP est un inhibiteur d'ATCase  ATP est un activateur d'ATCase  assure une production égale de purines + pyrimidines Biosynthèse des pyrimidines

12 ATCase V max ne change pas K prime change +CTP +ATP À noter:►K prime n'est pas la [S] à V max /2 ►ici à titre d'exemple seulement

13 ATCase  enzyme allostérique: cinétique non-michaelienne

14 BCM311 - résultats typiques +CTP +ATP

15 Michaelis-Menten d'ATCase

16 Organigramme - semaine 2  désensibilisation du site allostérique (A,D+E) Préparation d’ATCase de la première semaine Dosage d’ATCase sans effecteur (Série A) Dosage d’ATCase en présence de Hg (Série D) Dosage d’ATCase en présence de Hg + CTP (Série E)

17 Structure d'ATCase - séries A, D + E enzyme native, C 6 R 6, 300 kDa

18 Structure d'ATCase - séries A, D + E sous-unité catalytique (C 3 )  catalysent encore la réaction  souvent plus active que l’holoenzyme  cinétique michaelienne (courbe hyperbolique)  pas sous la régulation de CTP ou d’ATP

19 Structure d'ATCase - séries A, D + E

20 Structure d'ATCase - effet de Hg  ATCase+Hg plus active que natif  courbe hyperbolique  ATCase ne répond plus à CTP

21 Structure d'ATCase - effet de Hg

22  ATCase+Hg plus active que natif  courbe hyperbolique  ATCase ne répond plus à CTP

23 Points techniques  préparer suffisamment d’enzyme diluée pour effectuer les séries en question (A-C ou A+D+E)  diluer l’enzyme immédiatement avant son utilisation  garder l’enzyme sur glace en tout temps sauf durant l’incubation

24  préparer le réactif (attention: H 2 SO 4 ) colorimétrique juste avant son utilisation (protège-le de la lumière)  préparer seulement le volume du réactif requis (~210 ml; surplus à Will)  lire les DO rapidement après la terminaison des réactions: la couleur diminue avec le temps Lunettes et gants obligatoire Points techniques

25 Réactions  à 30 o C (bains personnels)  réactifs (tubes) préchauffés  laissez des intervalles assez longs  vérifiez la température des bains Points techniques

26  préparation des solutions 1.aspartate 125 mM (préparer 50 ml / table) 2.carbamyl phosphate 36 mM (préparer 50 ml / table)  solutions préparées semaine I 1.acide perchlorique 2% 2.tampon sodium phosphate 0,16 M pH 7,0 Points techniques

27 Études cinétiques = précision  chronométrage  concentrations/dilutions/volumes  homogène  température Points techniques

28 ATCase - questions ? aspartate Carbamyl phosphate carbamyl aspartate ATCase

29 ATCase - graphique de Hill  log (V/V max -V) vs log [aspartate]  pente = n h  besoin de V max  V max historiquement déterminé à l’aide des graphiques "linéaires" de Lineweaver-Burk et d'Eadie-Hofstee

30 ATCase - graphique de Hill  pour un enzyme allostérique, la courbe M+M est sigmoïde

31 ATCase - graphique de Hill  alors, les graphiques linéaires (LB et EH) ne sont pas  Comment déterminer K m et V max ?

32 Régression non-linéaire ("Curve fitting")  logiciels puissants (Graphpad)  utilise le formule MM pour les enzymes allostériques et détermine V max, K prime et n H pour que la courbe tracée suit les données

33 Régression non-linéaire ("Curve fitting") native +CTP +ATP

34 GraphPad 6 - utilisation dans BCM311  présentation PowerPoint disponible sur le site internet du cours  régression linéaire (courbe standard)  régression non-linéaire (Michaelis-Menten)  comparaison de modèles (ex. MM vs sigmoïde)

35 Analyse des données - Excel  préparez une « super » tableau avec toutes les données AVANT de faire les graphiques pour une série (ex. Série A)  bien identifier les colonnes (unités etc.)  copiez le tableau, changez les DO et tous les calculs se fait automatiquement pour la 2 e série

36 Analyse des données - Excel

37 1 µM = 1 µmole/L volume de réaction = 2 ml = 2 x L Alors: µmole CA = µM x 2 x L

38 Analyse des données - Excel = µmoles CA / (0,5 hr X 0,1 ml)

39 Analyse des données - Excel

40 Série A Série B

41 Cette semaine  nouvelle courbe standard  chaque équipe analyse ses propres résultats  analyse des résultats (graphiques MM) avec GraphPad en fin de journée (fichier à Will)  rapport à remettre dans 2 semaines


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