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Champignons toxinogènes et mycotoxicoses Patrick BOIRON Laboratoire de Mycologie, Faculté de Pharmacie, Lyon, France.

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1 Champignons toxinogènes et mycotoxicoses Patrick BOIRON Laboratoire de Mycologie, Faculté de Pharmacie, Lyon, France

2 Champignons induisant des manifestations cliniques chez l’homme Différences essentielles entre champignons Vénéneux (toxiques) : mycétismes Toxinogènes : mycotoxicoses Pathogènes stricts Opportunistes Allergènes : allergies fongiques mycoses

3 Champignons sur les denrées alimentaires Champignons « bénéfiques » : industries fromagères (Penicillium, Geotrichum) et viticoles (levures sauvages ou sélectionnées)

4 Champignons sur les denrées alimentaires La contamination initiale des denrées alimentaires non soumises à stérilisation ou pasteurisation, par des spores de moisissures est inévitable

5 Champignons sur les denrées alimentaires Champignons « indésirables » : moisissures (Rhizopus, Aspergillus, Penicillium, etc.) banales ou toxiques (Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus, Penicillium expansum, etc.)

6 Champignons sur les denrées alimentaires Le développement des moisissures sur les denrées alimentaires peut conduire : A une dépréciation de leur valeur nutritionnelle et une altération de leurs caractères organoleptiques, A des risques pour le consommateur (animal ou homme) et le manipulateur : mycoses (Aspergillus fumigatus), allergies (foin moisi), mycotoxicoses

7 Mycotoxines Métabolites secondaires de faible poids moléculaire

8 Mycotoxines Fixées au niveau des spores ou excrétées dans le milieu contaminé (aliments, eau)  toxicité potentielle ou réelle pour les hommes et les animaux par : Inhalation Ingestion Plus rarement, par contact

9 Mycotoxines Mycotoxines inhalées partiellement solubles dans l’eau pulmonaire des alvéoles :  circulation générale  troubles généraux respiratoires et/ou spécifiques d’organes (milieux professionnels industriels et agricoles ; domestique ?)

10 Mycotoxines Les connaissances concernent surtout les mycotoxicoses par ingestion (population générale)

11 Conditions physico-chimiques de développement Disponibilité en eau Température Composition gazeuse Influence du substrat

12 Disponibilité en eau Germination conditionnée par l’activité en eau (a w ) dans la spore Croissance du mycélium conditionnée par l’eau disponible dans le substrat Classification en : Xérophiles : Aspergillus restrictus, A. glaucus, A. versicolor Mésophiles : Aspergillus flavus, A. nidulans, A. fumigatus, Penicillium expansum, P. cyclopium Hygrophiles : Cladosporium, Fusarium, Mucorales

13 Température Conditionne la compétitivité Rôle prépondérant sur la croissance, le développement et la physiologie Eventail très large (optima : 20 – 25°C) Croissance / survie

14 Température Cladosporium herbarum : croît à – 6°C et survit à – 20°C Aspergillus flavus : survit à 35°C dans les tunnels de pâtes Aspergillus fumigatus tolère 55°C Byssochlamys germe après 10 min à 85°C Ascospores de Neurospora germent après 20 min à 130°C (four de boulangerie)

15 Température Classification en : Thermophiles : Byssochlamys, Aspergillus fumigatus, … Thermotolérants : Aspergillus niger, … Mésophiles : Penicillium chrysogenum, Aspergillus versicolor, … Cryophiles : Cladosporium, Alternaria, …

16 Composition gazeuse Moisisures aérobies Aérobies « tolérantes » Rôle limitant et sélectif du rapport O 2 / CO 2 Aptitude au confinement : Penicillium roqueforti Anaérobies rares : Byssochlamys nivea

17 Influence du substrat Rupture des défenses naturelles (graines, fruits, etc.) Résistance mécanique au tassement (volume d’air intergranulaire en stockage) Sélection naturelle des espèces cellulolytiques : Stachybotrys sur pailles Spécificité d’hôte : Penicillium expansum sur pommes A contrario : Penicillum roqueforti sur gélose !

18 Conditions biologiques de développement Intensité de la sporulation Longévité des spores Compétitivité entre espèces biologiques : Fongiques : Trichoderma viridae est presque exclusif Bactériennes : vitesse de croissance, pH, a w

19 Mycotoxicogénèse Grande diversité de familles chimiques (conséquence du métabolisme secondaire) Dérivés des acides aminés Alcaloïdes de l’ergot de seigle, acide aspergillique, gliotoxine, roquefortine, sporidesmines Voie des polyacétates Aflatoxines, acide pénicillinique, citrinine, fumonisines, ochratoxines, patuline, stérigmacystine, zéaralénone Dérivés des terpènes Diacétoxyscirpénol, déoxynivalénol, trichothécènes, verrucarines

20 Moisissure  ?  mycotoxine La présence – à un moment donné – d’une moisissure toxinogène est nécessaire pour qu’il y ait éventuellement production de mycotoxine La présence d’une moisissure – même toxinogène – n’implique pas obligatoirement la présence de mycotoxine L’absence de moisissure n’implique pas obligatoirement l’absence de mycotoxine

21 Exemple de produits contaminés par des moississures toxinogènes DenréesEspèces toxiques contaminantesMycotoxines probables Blé, farine, pain, maïs, chips - Aspergillus flavus, A. ochraceus, A. versicolor - Penicillium citrinum, P. citreoviride, P. cyclopium, P. martensii, P. patulum, P. pubertum - Fusarium moniliforme Aflatoxines, Ochratoxine A Stérigmatocystine Acide pénicillique Patuline Désoxynivalénol (DON) Zéaralénone Fumonisine Arachide, noix - Aspergillus flavus, A. ochraceus, A. versicolor - Penicillium citrinum, P. cyclopium, P. expansum Aflatoxines, Ochratoxine A Stérigmatocystine Trichothécènes Cytochalasines Patuline Acide cyclopiazonique

22 Exemple de produits contaminés par des moississures toxinogènes DenréesEspèces toxiques contaminantesMycotoxines probables Tourte à la viande, viande cuite, fromage, cacao, houblon - Aspergillus flavus - Penicillium viridicatum, P. roqueforti, P. patulum, P. commune Aflatoxines, Ochratoxine A Stérigmatocystine Acide pénicillique Patuline Viandes, porc salé, fromage - Aspergillus flavus, A. ochraceus, A. versicolor - Penicillium viridicatum, P. cyclopium Aflatoxines, Ochratoxine A Stérigmatocystine Acide pénicillique Patuline, Pénitrem A Poivre noir et rouge, pâtes - Aspergillus flavus, A. ochraceusAflatoxines, Ochratoxine A

23 Exemple de produits contaminés par des moississures toxinogènes DenréesEspèces toxiques contaminantesMycotoxines probables Fèves, orge, maïs, sorgho, soja - Aspergillus flavus, A. ochraceus, A. versicolor - Penicillium citrinum, P. cyclopium, P. viridicatum, P. expansum, P. islandicum, P. urticae - Fusarium moniliforme - Alternaria Aflatoxines, Ochratoxine A Stérigmatocystine Acide pénicillique Citrinine Patuline Griséofulvine Alternariol Pâtisserie réfrigérée ou congelée - Aspergillus flavus, A. versicolor - Penicillium citrinum, P. cyclopium, P. viridicatum, P. martensii, P. citreoviride, P. urticae, P. palitans, puberulum, P. roqueforti Aflatoxines, Ochratoxine A Stérigmatocystine Acide pénicillique Citrinine, Pénitrem A

24 Exemple de produits contaminés par des moississures toxinogènes DenréesEspèces toxiques contaminantesMycotoxines probables Denrée alimentaire (stockage domestique) - Aspergillus - Penicillium - Fusarium oxysporum Aflatoxine, Ochratoxine A Acide kojique Patuline, Pénitrem A Acide pénicillique Trichothécènes Pomme et produits dérivés de pomme - Penicillium expansumPatuline

25 Moisissures et mycotoxines retrouvées dans divers aliments ChampignonToxinesDenrées AspergillusAflatoxines, stérigmatocystine, ochratoxine A Maïs, arachides, graines de coton, graines de potiron, riz, haricot, tissus d’animaux (jambon, lard, saucisses, lait et dérivés FusariumTrichothécènes (désoxynivalénol = DON, nivalénol = NIV, toxine T2, diacétoxyscirpénol = DAS), zéaralénone, fumonisine, fusarine, moniliformine Blé, maïs, orge, riz, seigle, avoine, noix PenicilliumPatuline, citrinine, pénitrem A, acide cyclopiazonique, ochratoxine A Fruits et jus de fruits, blé, riz, fromage, noix AlternariaAlternariol, acide ténuazoniqueFruits, légumes et produits dérivés de pommes et tomates ClavicepsAlcaloïdes de l’ergotBlés et dérivés, seigle

26 Moisissures présentes dans les fourrages et produits en silo Espèce fongiqueMycotoxine Aspergillus flavus, A. parasiticus Aspergillus ochraceus Aspergillus fumigatus Aspergillus versicolor Penicillium veridicatum, P. cyclopium Penicillium aurantogriseum Penicillium roqueforti Pithomyces chartarum Wallamia sebi Stachybotris atra Aflatoxines, acide cyclopiazonique Ochratoxine A Fumigaclavines, gliotoxine Stérigmatocystine Ochratoxine A, citrinine, a cide cyclopiazonique Verrucosidine, viomelléine, xanthomégnine Fumiclavine, roquefortine, PR toxine Sporodesmine Walleminol A Satratoxines Espèce fongiqueMycotoxine Fusarium culmorum, F. graminearum, F. sporotrichoides Fusarium moniliforme Claviceps Alternaria Acremonium lolii Acremonium coenophialum Phomopsis leptostromiformis Désoxynivalénol (DON), toxine T2, diacétoxyscirpénol (DAS), zéaralénone Fumonisine, moniliformine Ergotamine, ergostine, ergocrystine, acide lysergique Acide ténuazonique, alternariol Lolitrem, paxilline Ergopeptine Phomopsines

27 Expression des mycotoxicoses CutanéeNerveuseVasculo- sanguine GénitaleHépato-biliaire et rénale Ergotisme Eczéma facial des ruminants Dermatose des manipulateurs de céleri (Gangrène sèche de la fétuque) (Hyperkératose des bovins) Clavatoxicose Diplodia-toxicose Sialorrhée des ruminants Leuco- encéphalomalacie des équidés (Maladie des tremblements) Aleucie toxique alimentaire Fusariotoxicose Stachybotriotoxicose Maladie du mélilot âgé Zéaralénone toxicose Phyto- oestrogènes : coumestrol Aflatoxicose Eczéma facial des ruminants Ochratoxicose (± citrinine) (Néphropathie endémique des Balkans) Phomopsis- toxicose (lupinose)

28 Formes aiguës de mycotoxicoses chez les animaux domestiques MycotoxicoseEspèces fongiques MycotoxinesEspèces animales Syndrome primaire FusarioseFusarium moniliforme Fumonisine B1PorcŒdème pulmonaire VomitoxicoseFusarium sporotrichoides DésoxynivalénolPorcEntérite, vomissements T2 toxicoseFusariumToxine T2Porc, veau, volailles Nécrose dermique, gastroentérite DAS toxicoseFusariumDiacétoxyscirpénolPorcNécrose du tube digestif, hémorragies Leucoencéphalom alacie Fusarium moniliforme Fumonisine B1CheveauIncoordination des mouvements F2 toxicoseFusarium graminearum ZéaralénonePorcOestrogénisme

29 Formes aiguës de mycotoxicoses chez les animaux domestiques MycotoxicoseEspèces fongiques MycotoxinesEspèces animales Syndrome primaire AflatoxicoseAspergillus spp.AflatoxinesVolailles, veau, porc, chien Hépatite, hémorragies, mort ErgotismeClavicepsAcide lysergiqueVeau, mouton, pouletGangrène, crise nerveuse, baisse de la reproduction Eczéma facialPhitomyces Chartarum SporidesminesMouton, veauPhotosensibilisation, cholangiome OchratoxicoseAspergillus ochraceus Penicillium viridicatum Ochratoxine APorc, dindons, volaillesNéphropathie StachybotryotoxicoseStachybotrys atraSatratoxine, verrucarineChevauxNécrose dermique, gastroentérite, dépression du système hématopoïétique TrémorAcremonium spp.Pénitrem AVeau, mouton, chienAtaxie, prostration Slaframine toxicoseSlaframineVeau, moutonSalivation, diarrhée, polyurie

30 Implication de mycotoxines dans des épidémies chez l’homme Maladie (aiguë) SymptômesEspèces fongiques Mycotoxines SubstratsPays Ergotisme gangréneux Vasoconstriction, gangrène Claviceps purpurea, C. fusiformis Alcaloïdes de l’ergot Seigle, céréalesEthiopie, Inde Aleucie toxique alimentaire (ATA) Brûlures digestives, nausées, vomissements Fusarium spp.TrichothécènesCéréales, painRussie, Japon, Corée Maladie de Kaschim-Beck Arthrite osseuse Fusarium spp.TrichothécènesCéréalesChine OnyalaiHémorragie du rhino-pharynx et tube digestif Phoma sorghina Acide ténuazonique MilletAfrique du Sud Béribéri cardiaque Anomalie cardiaque, mort par dépression respiratoire PenicilliumCitréoviridineRizJapon

31 Implication de mycotoxines dans des épidémies chez l’homme Maladie (aiguë) SymptômesEspèces fongiques Mycotoxines SubstratsPays KwashiorkorDénutrition énergétique Aspergillus parasiticus AflatoxinesCéréalesKenya, Soudan (enfant) Syndrome de Reye Accumulation d’acides gras : foie, rein, cœur, encéphalopathie, œdème Aspergillus parasiticus AflatoxinesCéréalesThaïlande (enfant) KoduaSomnolence, perte d’équilibre, troubles nerveux Aspergillus flavusAcide cyclopiazonique MilletInde Hépatite aiguëJaunisse, œdèmeAspergillus flavus, Aspergillus parasiticus AflatoxinesCéréales (maïs)Inde, Afrique DermatiteAllergie cutanéeSclerotiniaPsoralèneCéleri

32 Implication de mycotoxines dans des épidémies chez l’homme Maladie (chronique) SymptômesEspèces fongiques Mycotoxines SubstratsPays Cancer de l’œsophage TumeursFusarium spp.Fumonisine, fusarine C CéréalesAfrique du Sud Cirrhose (enfant) Nécrose du foieAspergillus spp.AflatoxineCéréalesInde Hépato- carcinomes Tumeur du foieAspergillus spp.AflatoxineCéréalesAfrique, Inde Néphropathie endémique Nécroses des tubules et glomérules Penicillium verrucosum Aspergillus ochraceus Ochratoxine ACéréalesEx-Yougoslavie, Bulgarie

33 Aflatoxines

34 Mycologie Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Penicillium verrucosum Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Penicillium verrucosum

35 Substrats Nombreux produits agricole (arachides, céréales, tourteaux d’arachides, cacahuètes, …) Incidence importante dans la nourriture animale et humaine en régions tropicales

36 Conditions de croissance des souches toxinogènes Températures : Minimale : 12 °C Maximale : 42 °C Optimale : 28 – 30 °C Humidité relative en eau : 80 % Infection au champ, mais surtout au stockage

37 Toxinogénèse La croissance des champignons toxinogènes et la production d’aflatoxines sont influencées par différents facteurs : Le type de substrat La teneur en humidité La température Les dommages éventuels du substrat L’humidité relative de l’environnement

38 Structures et propriétés physico- chimiques 1963 : Asao propose la structure chimique des aflatoxines : ce sont des flavocoumarines Stables à la chaleur (250 °C), au froid, à la lyophilisation Instables à la lumière et aux UV Hydrolysables en milieu alcalin Solubles dans les solvants peu polaires (méthanol)

39 Biosynthèse 1992 : Chang découvre le gène responsable de la biosynthèse des aflatoxines Le cluster (zone regroupant les gènes) des aflatoxines est situé sur un fragment de 7,5 kb d’un chromosome de 4,9 Mb La biosynthèse des aflatoxines est composée de 4 grandes étapes générant des intermédiaires issus de diverses réactions chimiques et enzymatiques sous le contrôle du cluster aflR

40 Métabolisme

41 Absorption Voie orale Leur lipophilie gouverne leur absorption par un phénomène de diffusion passive Maximale à un pH 5 et au niveau du jéjunum Voie respiratoire

42 Distribution Liaisons non covalentes avec l’albumine et l’hémoglobine Phénomène de diffusion pour pénétrer dans le cytoplasme Stockage dans l’organisme par liaisons covalentes avec molécules tissulaires Passage trans-placentaire

43 Pour être toxique ou mutagène, l’aflatoxine doit être métabolisée La métabolisation est principalement réalisée par l’intervention des cytochromes hépatiques : Epoxydation par l’intervention de cytochromes P450 hépatique et pulmonaire Hydroxylation O-déméthylation Epoxyde hydrolase ou glutathion-S- transférase Réduction en aflatoxicol par la NADPH réductase Métabolisation

44 Elimination Par voie biliaire Représente 60 % de l’élimination totale Surtout des métabolites conjugués Parfois aflatoxine B 1 sous forme libre Par voie urinaire Présence d’autres métabolites Servent de marqueurs dans les intoxications Par voie lactée Uniquement aflatoxine M 1 Problèmes pour l’allaitement Problèmes pour les denrées à base de lait

45 Biotoxicologie

46 Action sur les synthèses cellulaires Action sur l’ADN L’aflatoxine B 1 ou son époxyde peut s’intercaler au sein de l’ADN L’aflatoxine B 1 se fixe plus fortement dans les zones transcrites Cette fixation dépend de la séquence nucléotidique et de la taille du fragment Le site préférentiel est au niveau de la guanine dans les séquences contenant des cytosines

47 Action sur les synthèses cellulaires Action sur l’ARN L’aflatoxine B 1 a une grande affinité pour l’ARN nucléaire et cytoplasmique et elle en affecte le métabolisme par inhibition de l’activité de l’ARN- polymérase L’effet varie en fonction de la dose d’aflatoxine B 1

48 Action sur les protéines La synthèse des protéines intra- et extracellulaires est réduite

49 Action sur les métabolismes Métabolisme des glucides Réduction du glycogène hépatique Interférence avec le métabolisme énergétique des cellules animales Inhibition de la consommation d’oxygène des tissus

50 Action sur les métabolismes Métabolisme des lipides Accumulation de lipides dans le foie Diminution des concentrations sériques du cholestérol, des triglycérides, des phospholipides Perturbation de la synthèse et le transport des lipides Perturbation de l’absorption et la dégradation des lipides

51 Immunotoxicité Effets immunosuppresseurs après ingestion (et inhalation) Prédisposition à une surinfection par diminution des défenses immunitaires

52 Tératogénicité Malformations fœtales

53 Prévention

54 Prévention : lutte contre la contamination Avant la récolte Utilisation de souches aspergillaires non aflatoxicogènes : Agent biocompétitif En plein essor Uniquement dans les pays industrialisés car coûteuse

55 Prévention : lutte contre la contamination Autres moyens Élimination des pieds desséchés Irrigation suffisante Sélection de variétés de culture

56 Prévention : lutte contre la contamination Lors de la récolte Le ramassage A maturation Manuel ou mécanique Le nettoyage et la séparation Début du traitement industriel (taux résiduel d’aflatoxines possible)

57 Prévention : lutte contre la contamination Le séchage Teneur en humidité < 9 % Souvent à l’air libre en Afrique Le stockage Dans des silos le plus souvent Atmosphère contrôlée (température, humidité, CO 2, …)

58 Prévention : lutte contre la contamination Le triage Manuel Dans les pays sous développés Analyses macroscopiques et morphologiques Mécanique Sélection par pression – dépression Procédés Sortex, Zig-Zag, Wogan

59 Prévention : détoxification Les traitements physiques Inactivation thermique Inactivation totale à partir de 267 °C Diminution de la qualité et de la quantité des protéines Irradiation Rayon gamma, UV, micro-ondes Adsorption par les solvants Utilisation de boue, de charbon activé, …

60 Prévention : détoxification Les traitements chimiques Moins coûteux que les autres techniques Applicables sur les aliments, les concentrés, … Existence de deux sites d’ouverture entraînant l’inactivation de l’aflatoxine B 1

61 Prévention : détoxification Les traitements chimiques Ammoniation : méthode de référence Bisulfites Chlore : effets mutagènes Ozone : peu d’information Hypochlorite de sodium : grande efficacité Peroxyde d’hydrogène (uniquement en milieu liquide basique) : modification de la qualité protéique (et donc de la valeur nutritive)

62 Prévention : détoxification La décontamination biologique Bioconversion : Mucor griseocyanus

63 Ochratoxine A

64 Mycologie Genre Aspergillus Aspergillus ochraceus Aspergillus niger Aspergillus carbonarius

65 Mycologie Aspergillus ochraceus Croissance : température optimale de 24 à 37 °C ; pH de 3 à 10 Sur milieux de Czapek : colonies granuleuses de couleur ocre, revers brun jaunâtre

66 Mycologie Genre Penicillium Penicillium verrucosum ou Penicillium viridicatum Principal producteur d’ochratoxine A en climats tempérés (20 °C) Thalle velouté vert - bleu à vert - gris et revers orange- brun sur milieu CYA

67 Patuline

68 Mycologie La patuline est produites par des divers champignons appartenant aux genres : Penicillium : P. expansum, P. patulum, P. claviforme, … Aspergillus : A. clavatus, A. gigantus, A. terreus Paecilomyces variotii Byssochlamys : B. nivea, B. fulva

69 Penicillium expansum Principal responsable des contaminations Colonie verte terne, avec un mycélium blanc en marge et un exsudat orange brun caractéristique Champignon bi ou triverticillé, avec un conidiophore lisse, des métules et des phialides rassemblées en verticilles et des conidies elliptiques

70 Conclusion Connaissances scientifiques très insuffisantes : requièrent la collaboration de mycologues, médecins, pharmaciens, vétérinaires et toxicologues

71 Conclusion Principaux axes de recherche : Ecologie des champignons et conditions de sécrétion Moyens préventifs de lutte Méthodes chimiques et biologiques de détection rapide Détoxification sans dénaturation Recherche des mycotoxines comme causes possibles de maladies humaines mal connues


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