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Place des nouvelles techniques dans le diagnostic des infections à mycobactéries J. MAUGEIN CHU de Bordeaux.

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1 Place des nouvelles techniques dans le diagnostic des infections à mycobactéries J. MAUGEIN CHU de Bordeaux

2 LE DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE Direct à partir de l’échantillon Examen microscopique L’amplification génique La culture « gold standard » L’identification Par techniques de biologie moléculaire La sensibilité aux antibiotiques

3 Examen microscopique Directement sur l’échantillon ou après décontamination Coloration de Ziehl Neelsen ou auramine sensibilité : 50% pour les échantillons d’origine pulmonaire, < 40% pour les extra-pulmonaires Spécificité : ne permet pas de différencier les différentes espèces de mycobactéries Avantages : rapide et peu coûteux

4 AMPLIFICATION GENIQUE Détection du complexe tuberculosis – PCR (Polymerase Chain Reaction) – amplification d’un fragment du gène codant pour l’ARN16S – Amplicor, Roche Diagnostic, manuelle ou automatisée – TMA (Transcription Mediated Amplification) – amplification isotherme d’une séquence de l’ARN 16S – AMTD, bioMérieux, technique manuelle – SDA (Strand Displacement Amplification) – Amplification isotherme de DNA – BDProbeTec TM ET DT, Becton Dickinson, automatisée

5 AMPLIFICATION GENIQUE GenoType® Mycobacteria direct Complexe tuberculosis et 4 MNT – Amplification du rRNA 23S (NASBA) Complexe tuberculosis M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum M. kansasii M. malmoense Sensibilité – MTBC : 87.5%, MNT : 67% (6 souches)

6 Genotype® MTB Direct v3.0 Genotype® MTB Direct

7 AMPLIFICATION GENIQUE Sensibilité – Les résultats des études sont dépendants des échantillons testés résultats comparables selon les techniques pour les échantillons positifs à l’examen microscopique : 96 à 100% résultats différents selon les études et les techniques pour les échantillons négatifs à l’examen microscopique : 27 à 75% pour les échantillons d’origine pulmonaire différence majorée pour les échantillons extrapulmonaires Spécificité – 98 à 100% selon les études

8 AMPLIFICATION GENIQUE Comparaison des techniques

9 AMPLIFICATION GENIQUE Intérêt et indications Permet de faire le diagnostic différentiel entre complexe tuberculosis et MNT sur les échantillons positifs à l’examen microscopique Sa place est mal définie sur les échantillons négatifs à l’examen microscopique, mais permet cependant un diagnostic plus rapide que la culture dans environ 50% des cas à condition que le test soit pratiqué au moins une fois par semaine L’amplification génique est plus sensible que l’examen direct, mais moins que la culture C’est un test relativement coûteux Une amplification négative n’exclue jamais un diagnostic de tuberculose

10 TECHNOLOGIE DES PUCES A ADN Une puce à ADN est une petite surface contenant une multitude de sondes (oligonucléotides) de séquences différentes : sondes de captures

11 LA CULTURE Les milieux liquides systèmes automatisés : Bactec 460TB, méthode radiométrique, abandonné? Bactec 960TB (MGIT), Bactec 9000MB, BacT/Alert 3D Systèmes manuels : MGIT (Mycobacterial Growth Indicateur Tube) MB Redox, Bio FM, Middlebrook (7H9) enrichi en ADC

12 MGIT

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14 MB Redox

15 Comparaison des milieux MGIT, MB Redox, Löwenstein 494 échantillons (423 pulmonaires) Décontamination par BBL MycoPrep Les contaminations : MB redox : 8.7%, MGIT : 5.6%, Lowenstein 2.6%

16 Etude Bordelaise (respiratoire) JoursDirect Négatif< 1/champ1 – 10/champ> 10/champ < 7 jours4%18%55%80% 7 – 14 jours44%82%45%20% 15 – 21 jours40% 16%36%67%75% 22 – 30 jours12% 52%55%33%20% > 30 jours 12% Souillés 5101 TOTAL Nbre de souches MGIT - Lowenstein

17 LA CULTURE Avantages et inconvénients des milieux liquides – Une pousse plus rapide délai moyen de 6 à 12 jours pour les échantillons positifs à l’examen microscopique, 14 à 18 pour les négatifs. – Une sensibilité augmentée – Les contaminations par des bactéries à pousse rapide plus fréquentes nécessitent l’adjonction d’un cocktail antibiotique – Isolement plus fréquent de MNT sans implication pathologique – De rares souches ne poussent pas en milieu liquide La méthode de culture la plus performante associe milieux solides et liquides

18 IDENTIFICATION Identification du complexe tuberculosis – Les méthodes classiques – Techniques d’hybridation : très bonne spécificité et sensibilité Accuprobe (Gen-Probe) complexe ADN-ARN ribosomiaux, réalisée en 2 heures INNOLiPA (Innogenetics) nécessite l’amplification de l’ITS 16-23S, confirme le diagnostic de mycobactérie (7 à 8 H) GenoType Mycobacteria (Hain Diagnostika) même technique que INNOLiPA – Autres techniques : PRA (PCR Restriction Enzyme Analysis), séquençage de l’ARN 16S

19 Mycobacterial IdentificationSensitivitySpecificity Mycobacterium avium99.3%100% Mycobacterium intracellulare100% Mycobacterium avium complex99.9%100% Mycobacterium gordonae98.8%99.7% Mycobacterium kansasii92.8%100% Mycobacterium tuberculosis complex99.2%99.0% Accuprobe

20

21 LiPA MYCOBACTERIA v2

22 IDENTIFICATION Diagnostic d’espèce au sein du complexe tuberculosis – Technique classique Niacine test (production d’acide nicotinique) Réduction des nitrates en nitrites Résistance au TCH Sensibilité au pyrazinamide (M. bovis) Sensibilité à la cyclosérine (M. Bovis -M. Bovis BCG) – Hybridation moléculaire GenoType MTBC (Hain Diagnostika) basé sur le polymorphisme du gène gyrB – Les gènes MIRU

23 GenoType MTBC

24 SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES Méthodes phénotypiques – Méthode des proportions (Canetti, Rist et Grosset) réalisée en milieux solides adaptée aux milieux liquides MGIT permet d’obtenir des résultats entre 5 et 12 jours, à partir de la primo culture – Technique de Heiffets, détermination de la CMI, pour les antibiotiques autres que les antituberculeux en cas de multirésistance.

25 SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES Méthodes génotypiques INNOLiPA Rif Tb pour la résistance à la rifampicine, sensibilité de 90 à 97% et spécificité proche de 100% – GenoType® MTBDR : sensibilité de 99% pour la rifampicine et 88.4 pour l ’INH – Séquençage des gènes impliqués dans la résistance pour d’autres molécules, mais du domaine des laboratoires spécialisés.

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27 DIAGNOSTIC SEROLOGIQUE Un test commercialisé : ANDA TB – Technique ELISA utilisant l’antigène A60 de M. bovis – Sensibilité peu satisfaisante, surtout dans les formes extrapulmonaires Nombreuses recherches en cours sur les antigènes, quelques résultats encourageants mais rien de commercialisé

28 TYPAGE MOLECULAIRE La RFLP (polymorphisme de longueur des fragments de restriction) – technique de référence, fastidieuse mais peu onéreuse Le spoligotypage (polymorphisme des régions inter DR) – plus rapide, moins sensible Les MIRU (séquences répétitives en nombre variable) – Interprétation délicate

29 CONCLUSION Les nouvelles techniques reposent essentiellement sur la biologie moléculaire mais aussi sur les techniques de culture en milieu liquide – l’amplification génique doit être considérée comme une aide au diagnostic et ne jamais être interprétée seule – L’identification du complexe tuberculosis se fait à partir de la culture en 2 heures par hybridation moléculaire. – La culture est indispensable et devrait combiner milieux solides et liquides. Ces derniers permettent de réduire significativement le délai de pousse. Permettent d’obtenir un antibiogramme en 7 à 12 jours


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