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Phénotypage de la réparation de lADN de lignées Xeroderma pigmentosum, par un test in vitro multiparamétrique Anne-Laure RAFFIN Soutenance de thèse : 5.

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1 Phénotypage de la réparation de lADN de lignées Xeroderma pigmentosum, par un test in vitro multiparamétrique Anne-Laure RAFFIN Soutenance de thèse : 5 Juin 2009 Thèse préparée au laboratoire Lésions des Acides Nucléiques Directrice de thèse: Dr. Sylvie SAUVAIGO

2 PLAN Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin Introduction La réparation de lADN Le Xeroderma pigmentosum Les outils pour étudier la réparation de lADN 2.Objectifs 3.Matériels et Méthodes Préparation des lysats cellulaires Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo 4.Résultats Le niveau basal de réparation Réponse à une irradiation UVB Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation 5.Conclusions et perspectives

3 PLAN Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin Introduction La réparation de lADN Le Xeroderma pigmentosum Les outils pour étudier la réparation de lADN 2.Objectifs 3.Matériels et Méthodes Préparation des lysats cellulaires Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo 4.Résultats Le niveau basal de réparation Réponse à une irradiation UVB Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation 5.Conclusions et perspectives

4 LALTÉRATION DE LA MOLÉCULE DADN Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Double hélice dADN ADN lésé Lésion de lADN Source de dommages Introduction: la réparation de lADN

5 LES RÉPONSES CELLULAIRES FACE AUX DOMMAGES DE LADN Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 cellule Arrêt réplicationArrêt de la transcription Source endogène ou exogène de dommage Lésions de lADN Mutagénèse - Restauration de la séquence dADN - Reprise du cycle cellulaire Réparation de lADN Cancérogenèse Apoptose Introduction: la réparation de lADN

6 LES DIFFÉRENTES LÉSIONS DE LADN Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 XU XXX A G T X X CH 3 C (CH 3 ) n T XX Site abasique Adduits volumineux Dimère de Pyrimidine Coupure double brins Pontages intra et inter-brin UracileModification de la base Alkylation mésappariement O 6 methyl guanosine Introduction: la réparation de lADN

7 LES DIFFÉRENTES LÉSIONS DE LADN Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 XU XXX A G T X X CH 3 C (CH 3 ) n T XX Site abasique Adduits volumineux Dimère de Pyrimidine Coupure double brins Pontages intra et inter-brin UracileModification de la base Alkylation mésappariement O 6 methyl guanosine Petites lésions: modifient la structure chimique des composants de lADN mais ne déforment pas la double hélice Introduction: la réparation de lADN

8 LES DIFFÉRENTES LÉSIONS DE LADN Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 XU XXX A G T X X CH 3 C (CH 3 ) n T XX Site abasique Adduits volumineux Dimère de Pyrimidine Coupure double brins Pontages intra et inter-brin UracileModification de la base Alkylation mésappariement O 6 methyl guanosine Lésions volumineuses: modifient la structure chimique des composants de lADN et déforment la double hélice Introduction: la réparation de lADN

9 LES DIFFÉRENTS VOIES DE RÉPARATION DE LADN Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 XU XXX A G T X X CH 3 C (CH 3 ) n T XX BERNERNHEJ / HRMMRDR BER: Base Excision Repair NER: Nucleotide Excision Repair NHEJ: Non-Homologous End joining HR: Homologous Recombination MMR: MisMatch Repair DR: Direct Reversal Introduction: la réparation de lADN

10 LES ÉTAPES ET FACTEURS DE LA BER ET DE LA NER Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Reconnaissance du dommage BER NER XPC, (XPE), XPA and TFIIH Glycosylases Excision du dommage Glycosylases + AP endonucléase Endonucléases XPG et XPF-ERCC1, XPA Resynthèse de lADN Polymérases δ, ε, RPA, XPA? Polymérase β + Polymérases δ, ε Ligature Ligase ILigase III ou I Base Excision RepairNucleotide Excision Repair GG et TC-NER Introduction: la réparation de lADN

11 LES ADN N-GLYCOSYLASES ET LAPE1 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Substrats: petites lésions de lADN Introduction: la réparation de lADN Fonction des ADN N-glycosylases: coupure de la liaison N-Glycosidique Spécificité des ADN N-Glycosylases: un type de dommage ou un groupe de dommages Exemple dADN N-Glycosylases: UNG (Uracile), OGG1 (8-oxoG), NTH1 (Diol de Thymine, 5 Formyluracile), NEIL1 (Diol de Thymine, Fapy-A, Fapy-G, 8-oxoG) Fonction de APE1 et des ADN N-Glycosylases bifonctionnelles : coupure de la liaison phosphodiester

12 LES RÔLES DE XPA ET XPC Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Substrats: lésions volumineuses de lADN Introduction: la réparation de lADN XPC: – Spécificité dintervention: uniquement réparation globale du génome – Fonction: Reconnaissance de lADN endommagé (1 er facteur à intervenir) XPA: – Spécificité dintervention: réparation globale du génome et réparation couplée à la transcription – Interactions avec dautres facteurs de la NER: TFIIH, ERCC1 et RPA – Fonction(s): « Chef dorchestre » de la NER: de la reconnaissance du dommage à la resynthèse de lADN = Rôle complexe qui reste encore à clarifier

13 BERNER Incision oligo 8-oxoG par système reconstitué de la NER (Reardon et al., 1997) XPC stimule activité de la TDG (Schimizu et al., 2003), OGG1 (dErrico et al., 2006 ; Bernardes de Jesus et al., 2008) hHR23 (A et B) stimule MPG (Miao et al., 2000) RPA interagit avec UNG (Nagelhus et al., 1997 ; Mer et al., 2000) XPG stimule NTH1 (Bessho et al., 1999 ; Klungland et al., 1999) Les cellules XPA sont plus sensibles à un stress oxydatif que des cellules saines (Lipinski et al., 1999 ; Dusinska et al., 2006 ; Low et al., 2008) LES INTERACTIONS ENTRE LES SYSTÈMES DE RÉPARATION Introduction: la réparation de lADN

14 BERNER Incision oligo 8-oxoG par système reconstitué de la NER (Reardon et al., 1997) XPC stimule activité de la TDG (Schimizu et al., 2003), OGG1 (dErrico et al., 2006 ; Bernardes de Jesus et al., 2008) hHR23 (A et B) stimule MPG (Miao et al., 2000) RPA interagit avec UNG (Nagelhus et al., 1997 ; Mer et al., 2000) XPG stimule NTH1 (Bessho et al., 1999 ; Klungland et al., 1999) Les cellules XPA sont plus sensibles à un stress oxydant que des cellules saines (Lipinski et al., 1999 ; Dusinska et al., 2006 ; Low et al., 2008) LES INTERACTIONS ENTRE LES SYSTÈMES DE RÉPARATION Introduction: la réparation de lADN

15 LES CARACTÉRISTIQUES DU XERODERMA PIGMENTOSUM Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin : relation XP – déficience de la NER (Cleaver 1968) 7 groupes XP (A à G): déficience dune protéine de la NER + XPV Hypersensibilité aux UV : apparition de lésions pigmentaires dès le plus jeune âge Apparition cancer: risque multiplié par Tumeurs de la peau vers lâge de 8 ans (Daya-Grosjean et al. 1995) Certaines formes: troubles neurologiques Espérance de vie: ans (XP classiques) (de Boer and Hoejmakers 2000) Pas de traitement Diagnostic: test UDS (Unscheduled DNA Synthesis) Introduction: le Xeroderma pigmentosum

16 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 LES AVANTAGES ET INCONVÉNIENTS DES TESTS DE MESURE DE LA RÉPARATION DE LADN Vision minimaliste de la réparation de lADN: une lésion étudiée à la fois Test in vitro sur support permettant une mesure conjointe de la réparation de plusieurs lésions à partir dun seul lysat cellulaire Introduction: Les outils pour étudier la réparation

17 PLAN Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin Introduction La réparation de lADN Le Xeroderma pigmentosum Les outils pour étudier la réparation de lADN 2.Objectifs 3.Matériels et Méthodes Préparation des lysats cellulaires Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo 4.Résultats Le niveau basal de réparation Réponse à une irradiation UVB Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation 5.Conclusions et perspectives

18 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 LES OBJECTIFS DE LÉTUDE Proposer un outil de diagnostic de la maladie XP alternatif à lUDS – Fiabilité – Rapidité – Sensibilité – Peu de cellules Utiliser loutil « puce réparation » pour caractériser des phénotypes de réparation de lADN de lignées XP Objectifs Etudier la réparation de lADN de lignées XPA et XPC – Quel est le niveau basal de réparation? Influence de la concentration protéique – Quelle est la réponse à un traitement génotoxique? UVB

19 PLAN Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin Introduction La réparation de lADN Le Xeroderma pigmentosum Les outils pour étudier la réparation de lADN 2.Objectifs 3.Matériels et Méthodes Préparation des lysats cellulaires Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo 4.Résultats Le niveau basal de réparation Réponse à une irradiation UVB Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation 5.Conclusions et perspectives

20 LA PRÉPARATION DES LYSATS CELLULAIRES Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Tampons ioniques Protéines Test in vitro de la réparation dosage Matériels et Méthodes Congélation DMSO+SVF +milieu Fibroblastes SV40 de patients XP 3 à 5 x 10 6 cellules (Test en solution de Wood et al.: 10 9 cellules)

21 LE PRINCIPE DES TESTS IN VITRO DE MESURE DE LA REPARATION Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 [support avec ADN lésé] + [lysat cellulaire] = Réparation !!! Puce Oligo Puce Plasmide Gain de fluorescence Matériels et Méthodes lésions plasmide surface de la biopuce incubation avec lysat cellulaire + nucléotides marqués Cy5 Excision des lésions + Resynthèse

22 LES LÉSIONS DE LA PUCE PLASMIDE Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin oxoGuanine Diols de pyrimidine 6-4 PP Photoproduits + T-T CPD N N N N N OH R O OH N N N N N OH R + Bases alkylées Adduits Cisplatine GGGG Pt NH 2 AT CTAGCATGGCC TACGA CGT CCGG Sites abasiques Matériels et Méthodes

23 PARAMÈTRES MESURÉS Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Phénotype de réparation Quantification de la fluorescence totale Matériels et Méthodes Part relative de lintensité de fluorescence des différentes lésions Soustraction du contrôle Somme des Intensité de fluo pour la même lésion Profil dER (Excision-Resynthèse)

24 LE PRINCIPE DES TESTS IN VITRO DE MESURE DE LA REPARATION Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 [support avec ADN lésé] + [lysat cellulaire] = Réparation !!! Puce Oligo Puce Plasmide fluorophore Cy3 lésions oligonucléotide surface de la biopuce incubation avec lysat cellulaire Excision des lésions Perte de fluorescence Matériels et Méthodes Gain de fluorescence lésions plasmide surface de la biopuce incubation avec lysat cellulaire + nucléotides marqués Cy5 Excision des lésions + Resynthèse

25 LES ACTIVITÉS ENZYMATIQUES MESURÉES AVEC LA PUCE OLIGO Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin NTH1: Diol de thymine, Dihydrothymine - NEIL1?: Diol de thymine, Dihydrothymine - UNG: Uracile (U-A ou U-G) - SMUG1: Uracile (U-A ou U-G) - TDG: Mésappariement G-T - MBD4: Mésappariement CG-GT - MPG: Ethénoadénine - APE1: THF (équivalent site abasique) Matériels et Méthodes

26 PLAN Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin Introduction La réparation de lADN Le Xeroderma pigmentosum Les outils pour étudier la réparation de lADN 2.Objectifs 3.Matériels et Méthodes Préparation des lysats cellulaires Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo 4.Résultats Le niveau basal de réparation Réponse à une irradiation UVB Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation 5.Conclusions et perspectives

27 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Résultats: Niveau basal de réparation 0,3 mg/mL - Déficience pour la réparation des lésions prises en charge par la BER et la NER Implication de la protéine XPC dans la réparation des petites lésions Phénotype XPC Phénotype Témoin PHÉNOTYPE DEXCISION-RESYNTHÈSE AVEC UNE CONCENTRATION PROTÉIQUE STANDARD (1) Lysat témoin

28 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Résultats: Niveau basal de réparation Phénotype XPA = Phénotype Témoin à cette concentration protéique Rôle de XPA dans la réparation de la 8-oxoG? Pas de rôle établi dans la littérature (Klein et al., 1992; Dusinska et al., 2006 Rünger et al., 1995) PHÉNOTYPE DEXCISION-RESYNTHÈSE AVEC UNE CONCENTRATION PROTÉIQUE STANDARD (2) 0,3 mg/mL Lysat témoin

29 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Résultats: Niveau basal de réparation PHÉNOTYPE DE RÉPARATION DE LADN DE LYSATS TOTAUX La discrimination des phénotypes XP est encore plus difficile avec les lysats totaux ER XPC = 85 % du témoin ER XPA = 100 % du témoin Lysat témoin

30 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Résultats: Niveau basal de réparation PHÉNOTYPE DEXCISION DE LYSATS NUCLÉAIRES - Activités glycosylases et APE1 équivalentes dans tous les lysats testés sauf pour lexcision des diols de thymine - Le lysat XPA excise les diols de thymine avec une plus faible efficacité que le lysat témoin: interaction XPA avec NTH1, NEIL1?

31 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Résultats: Niveau basal de réparation CONCLUSIONS NIVEAU BASAL DE RÉPARATION Niveau basal + concentration standard de protéines – XPC < Témoin – XPA = Témoin XPC joue un rôle dans la réparation des petites lésions BER et XPA? ? Faire varier des paramètres expérimentaux pour gagner de linformation

32 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Résultats: Effet dune irradiation UVB PARAMÈTRES MESURÉS EN RÉPONSE AUX UVB Exposition des cellules aux UVB (attention à la confluence) 0, 5 et 20 J/m² 24 h Cycle cellulaire (Cytométrie en flux) Cytotoxicité (test MTT) Réparation de lADN (test in vitro dER)

33 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Résultats: Effet dune irradiation UVB CYTOTOXICITÉ 24H APRÈS UNE IRRADIATION UVB Les cellules XP sont plus sensibles aux UVB

34 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Résultats: Effet dune irradiation UVB CYCLE CELLULAIRE 24H APRÈS UNE IRRADIATION UVB 0 J/m² 5 J/m² 20 J/m² 0J/m²20J/m² 0J/m² 20J/m² 0J/m² 20J/m² Fibroblastes * * ** * *

35 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Résultats: Effet dune irradiation UVB CYCLE CELLULAIRE 24H APRÈS UNE IRRADIATION UVB 0 J/m² 5 J/m² 20 J/m² Fibroblastes * * ** * * Les cellules XP réagissent différemment des cellules témoin suite aux UVB XPC XPA 5 J/m²

36 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Résultats: Effet dune irradiation UVB EXCISION-RESYNTHÈSE EN RÉPONSE AUX UVB (24H) Stimulation de lER avec le lysat nucléaire témoin Après lirradiation UVB des cellules : Stimulation Inhibition

37 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Résultats: Effet dune irradiation UVB EXCISION-RESYNTHÈSE EN RÉPONSE AUX UVB (24H) Peu ou pas deffet de lirradiation sur la réparation des lysats XP Après lirradiation UVB des cellules : Inhibition Stimulation

38 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Résultats: Effet dune irradiation UVB CONCLUSIONS RÉPONSE AUX UVB UVB + concentration standard de protéines – Stimulation des activités dER avec le lysat nucléaire témoin – Pas de stimulation pour les lysats XP Meilleure discrimination des phénotypes de réparation après un traitement préalable des cellules Rappel: Sans irradiation, XPA = Témoin Translocation des protéines de réparation vers le noyau en réponse à un traitement génotoxique: XPA (Wu et al., 2007), XPD (Fung et al., 2008) Néo-synthèse des protéines de la réparation en réponse à lirradiation UV

39 PLAN Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin Introduction La réparation de lADN Le Xeroderma pigmentosum Les outils pour étudier la réparation de lADN 2.Objectifs 3.Matériels et Méthodes Préparation des lysats cellulaires Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo 4.Résultats Le niveau basal de réparation Réponse à une irradiation UVB Effet de la concentration protéique sur le phénotype de réparation 5.Conclusions et perspectives

40 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Résultats: Effet de la concentration protéique EFFET DE LA CONCENTRATION PROTÉIQUE SUR LE PHÉNOTYPE DE RÉPARATION DU LYSAT TÉMOIN (1) Plus de protéines: cinétique différente suivant les lésions (vitesse initiale, plateau, allure biphasique) 0,9 mg/mL protéines 0,3 mg/mL protéines Mécanismes différents suivant la concentration? Lysat nucléaire témoin

41 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Résultats: Effet de la concentration protéique Augmentation de la part relative dER des photoproduits, des adduits du cisplatine et de la 8-oxoG Activités NER et réparation de la 8-oxoG favorisées à forte concentration Lysat nucléaire témoin 0,3 mg/mL0,9 mg/mL EFFET DE LA CONCENTRATION PROTÉIQUE SUR LE PHÉNOTYPE DE RÉPARATION DU LYSAT TÉMOIN (2)

42 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Résultats: Effet de la concentration protéique EFFET DE LA CONCENTRATION PROTÉIQUE SUR LES PHÉNOTYPES DE RÉPARATION XP Lysat XPC Lysat témoin Lysat XPA Nette diminution du niveau relatif de réparation de XPA à partir de 0,7 mg/mL (sauf pour les diols de pyrimidine) Lysat témoin Léger effet de la concentration sur le niveau relatif dER du lysat nucléaire XPC pour les photoproduits, les adduits du cisplatine et la 8-oxoG pCPD-64 p8oxoG pAlkB pCisP pAbaS pGlycol

43 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Résultats: Effet de la concentration protéique CONCLUSIONS EFFET DE LA CONCENTRATION PROTÉIQUE Niveau basal + beaucoup de protéines – Meilleure efficacité des activités NER et de réparation de la 8-oxoG – Peu deffet de la concentration sur le profil relatif de XPC – Effet de la concentration sur le profil relatif de XPA Rappel: avec peu de protéine, XPA = Témoin Meilleure discrimination des phénotypes XP à fortes concentrations protéiques

44 DISCUSSION CRITIQUE DES RÉSULTATS (1) Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Nos tests in vitro dexcision-resynthèse et dexcision permettent dappréhender la réparation de lADN comme un réseau enzymatique dynamique et complexe Résultats Les ratios Protéines / ADN ou Protéines / Lésions sont des paramètres à prendre en considération lors des tests in vitro Les niveaux de réparation obtenus pour XPA et XPC sont supérieurs à ceux de la littérature obtenus avec dautres méthodes de mesure in vivo (Athas et al., 1991; Cleaver 2005) et in vitro (Masutani et al., 1993) Le niveau basal avec la concentration standard est à considérer: il apporte de nouvelles informations quant aux régulations et mécanismes mis en jeu à de telles concentrations protéiques. Que se passe-t-il in vivo?

45 DISCUSSION CRITIQUE DES RÉSULTATS (2) Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Résultats Stimulation de la réparation en réponse aux UVB Stimulation des activités NER et de la 8-oxoG à forte concentration ? 2. Irradiation UVB 3. Augmentation de la concentration protéique Stimulation des activités NER et de la 8-oxoG: Implication des facteurs XP dans la réaction dER Discrimination possible 1. Niveau basal + concentration protéique standard Activités NER limitantes? A quoi est dû le niveau basal? Discrimination difficile

46 PLAN Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin Introduction La réparation de lADN Le Xeroderma pigmentosum Les outils pour étudier la réparation de lADN 2.Objectifs 3.Matériels et Méthodes Préparation des lysats cellulaires Tests in vitro: puce plasmide et puce oligo 4.Résultats Le niveau basal de réparation Réponse à une irradiation UVB Effet de la concentration protéique sur le phénotype dER 5.Conclusions et perspectives

47 BILAN: TESTS IN VITRO DE MESURE DE LA RÉPARATION DE LADN Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Conclusions et perspectives Informations complémentaires

48 APPLICATION DU TEST AU DIAGNOSTIC DES PATIENTS XP (1) Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Niveau basal avec concentration protéique standard : faible discrimination des phénotypes XP DIAGNOSTIC ? Irradiation des cellules au préalable Augmentation de la concentration protéique Meilleure discrimination des phénotypes XPA et XPC Approfondir létude à tous les groupes de complémentation, de A à G Approfondir les phénotypes et arriver à déterminer une signature de la réparation de lADN pour chaque groupe XP pour pouvoir clairement les identifier Conclusions et perspectives

49 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Tester des petites molécules: M 1 APPLICATION DU TEST AU DIAGNOSTIC DES PATIENTS XP (2) [M 1 ]= 0,1 mM [Lysat nucléaire]= 0,7 mg/mL M 1 0 mM Profil de XPC très différent de XPA En utilisant des petites molécules, il serait possible de discriminer facilement les différents groupes de complémentation? Conclusions et perspectives

50 PERSPECTIVES Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Fibroblastes primaires: Confirmer les résultats obtenus à partir des lignées Amélioration du test : nature des lésions (photoproduits: séparer les CPDs des 6-4 PPs) Comprendre la signification du niveau basal Approfondir leffet de la concentration sur les activités de réparation (lysats totaux, autres groupes de complémentation) Rôle de XPA dans la réparation des dommages oxydatifs? Hypothèse: Relation avec les troubles neurologiques développés par ces patients Echantillon: arriver à travailler à partir dun prélèvement sanguin? Conclusions et perspectives

51 Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Remerciements Laboratoire FRE 29-39, IGR, Stabilité génétique et oncogenèse (Pr. Alain Sarasin) Laboratoire CEA, Stabilité génétique et oncogenèse (Dr. Denis Biard) Laboratoire CEA, Plateforme cytométrie en flux, iRTSV (Véronique Collin-Faure, Serge Candéias) CEA, INSTN, Contrat de Formation par la Recherche Sylvie Sauvaigo Zohra Termache Sylvain, Francette, Jocelyne, Gwenaëlle … Et tout le LAN Florence Pivard et Sandrine Bessette, stagiaires ESTBB en 2007 et 2008 MERCI!

52 TITRE DE DIAPO Anne-Laure RAFFIN – Soutenance de thèse 5 Juin 2009 Partie


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