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Bases microbiologiques pour les cliniciens Dr Joaquim MATEO Département dAnesthésie Réanimation SMUR Hôpital Lariboisière, Paris

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Présentation au sujet: "Bases microbiologiques pour les cliniciens Dr Joaquim MATEO Département dAnesthésie Réanimation SMUR Hôpital Lariboisière, Paris"— Transcription de la présentation:

1 Bases microbiologiques pour les cliniciens Dr Joaquim MATEO Département dAnesthésie Réanimation SMUR Hôpital Lariboisière, Paris

2 Microbiologie clinique ORIENTATION DIAGNOSTIC ET THERAPEUTIQUE –LIEN OBLIGATOIRE AVEC LE LABORATOIRE –Compétence –Alerte –Equipement, médecins, recherche –Responsabilité conjointe –partenariat INTERET MAJEUR –Structure de la bactérie / implications cliniques –Diagnostic en microbiologie clinique –Traitement antibiotique –Résistance aux antibiotiques –Dosage dantibiotique ECOLOGIE ET EPIDEMIOLOGIE BACTERIENNE EN REANIMATION

3 Pathologie infectieuse et anesthésie réanimation Pathologie omniprésente –Chirurgie septique, choc septique –Complications chirurgicales postopératoires –Médical Environnement –Antibioprophylaxie –Infection nosocomiale –hygiène

4 Qualité : paramètre dévaluation Antibiothérapie : contrôle et coût Écologie bactérienne à lhôpital Transmission des bactéries multirésistantes Taux dinfections nosocomiales « AAA »

5 Intérêt du diagnostic précis et du traitement précoce et adapté des infections en réanimation

6 Pourquoi connaître la microbiologie ? Diagnostic et orientation thérapeutique

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8

9 Bases microbiologique : la bactérie Plus de bactéries que de cellules dans lorganisme humains Virus, champignons, parasites, prions

10 %

11 Table 3–4. Known and Estimated Numbers of Biologic Species. 1 GroupKnown Species Estimated Total Species Percentage of Known Species Viruses5,000130,0004% Bacteria4,76040,00012% Fungi69,0001,500,0005% Algae40,00060,00067% Protozoa30,800100,00031%

12 Structure des bactéries

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15 La paroi Toutes sauf mycoplasme structure constante la plus externe Intégrité indispensable a la survie 2 types –Paroi épaisse et dense : peptidoglycane ( chaine glucidique reliées entre elles par des peptides) –Paroi fine et lâche Peptidoglycane Membrane externe : lipides ( phospholipides et lipopolysaccharide ) (Mb cellulaire) Espace périplasmique (penicillinase)

16 Paroi fine

17 Paroi épaisse

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19 Paroi externe

20 Paroi : implications cliniques Identification GRAM Antigene LPS Multiplication \ Bactéricidie Efflux Porine

21 Fonction de la membrane Permeabilité et Transport –Diffusion –Binding Protein-Dependent Transport –Chemiosmotic-Driven Transport –Chemotactic Systems Membrane externe –bilayered structure; – lipopolysaccharide (LPS) – antigénémie antigène O Cible des antibiotiques Mort si Mb altérée porine

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23 IDENTIFICATION

24 Coloration de GRAM Distingue les bactéries à parois épaisse et fine Fixation des bactéries sur lame Coloration violet de gentiane Mordance à la solution de Lugol Lavage à lalcool –Décoloration des parois fines –Parois épaisses restent violette Surcolore par de la Fushine

25 GRAM - GRAM +

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28 Klebsiella pneumonia BGN

29

30 CG+amas

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32 Poils Pili communs courts, cassants Adhésion donc virulence Protéines : la piline Antigénémie Déplacement \ mobilité Pili sexuels Relient 2 bactéries Échange de matériel génétique Détermine le sexe Les pili

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38 La mobilité Examen direct, état frais Invasivité Colonisation du materiel (KT,SU…) Certaines bactéries sont très mobiles Leur déplacement est caractéristique ORIENTATION DIAGNOSTIQUE

39 Exemples pyo coli

40 KP

41 Le matériel nucléaire Pas de noyau Chromosome unique, circulaire Un filament hélicoidal dADN bicaténaire 4 bases A-T-G-C Support des information transmises aux ribosomes pour les synthèses Cible des quinolones

42 Eléments circulaires : matériel génétique extra-chromosomique ADN Autonomes Se réplique indépendamment du chromosome Synthèse protéique Utilisation de substrat Résistance aux antibiotiques Transmissibles à dautres bactéries (BLSE) Transmission horizontale Les plasmides

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44

45 la spore Conditions défavorables de survie (bacilles Gram + : Bacillus et Clostridium) formation de spores Sporulation. Conditions favorables bactéries végétatives Germination. La spore contient, sous forme condensée, le génome une partie du cytoplasme déshydraté autour d'une enveloppe très résistante. forme de résistance des bactéries contaminations d'origine tellurique (tétanos, charbon, C difficile).

46 Sporulation Très résistant –Sporicide –désinfection Manuportéee Aéroportée Résiste au solutions hydro-alccolique

47 Bactériostatique Inhibition de la multiplication bactérienne Bactéricide Mort de la bactérie, dissolution, ne peut plus se reproduire, IRREVERSIBLE Stérilisation Processus physique ou chimique qui détruit complètement toute bactéries vivante SPORES inclues Désinfectants Produits capables de tuer les microorganismes sur des objets ou des surfaces inertes. Les désinfectants sont sporostatiques mais pas obligatoirement sporicides. Septic Caractérise la présence de bactéries vivantes dans les tissus humains. Antiseptic Destruction ou blocage de la multiplication des microorganismes dans des tissus vivants. Aseptic absence de microorganismes pathogènes. Preservation (conservateur) Prévenir la multiplication des microorganismes dans des produits pharmaceutiques ou lalimentation..

48 Clostridium Difficile & Diarrheal Disease Pseudomembranous Colitis « difficile » Anaérobie, sporulé Spores : sols, hôpitaux… La forme active de la bactérie : intestin Germe G+, la spore G- COMMENSAL Transmission féco-orale 2 toxines A et B –Enterotoxine : perméabilté –Cytotxine : ç épithéliale Temps transit absorption Diarrhée

49 Infections à anaérobies La majorité des bactéries de la flore humaine normale sont anaérobies. Leur présence en dehors des sites habituelles (tissus,espaces anatomiques) entraine une infection. Caractéristiques –(1) Toujours en continuité avec une muqueuse –(2) souvent plurimicrobienne. –(3) tendance a former des espaces clos comme des abcès (poumons,cerveau,plèvre,péritoine,pelvis) et a creuser les couches de tissus. –(4) Pus est extrèmement malodorant. –(5) Sensible à la penicilline sauf Bactéroides et prevotella. –(6) favoriser par la baisse du débit sanguin localement, tissu nécrotique, pas de diffusion des ATB. –(7) Milieux de transport spéciaux, méthode de culture adaptées. Diagnostic difficile et souvent pas de mise en évidence

50

51

52 PORINE Membrane externe Permet la diffusion passive des composés hydrophyles de bas poids moléculaire –Sucres –Acides aminés –Ions Pénétration lente des gros antibiotiques Modification des porines \ résistance

53 PLP

54 Imperméabilité au Tienam chez Pseudomonas aeruginosa Efflux

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58 La multiplication bactérienne

59 The Meaning of Growth Table 4–2. Phases of Microbial Growth Curve. Section of CurvePhaseGrowth Rate ALagZero BAccelerationIncreasing CExponentialConstant DRetardationDecreasing EMaximum stationaryZero FDeclineNegative (death)

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62 La paroi et la multiplication

63 PLP

64

65 2 Élongation PLPe 3 Septalisation PLPs bactérie Élongation PLPe Filament pas de PLPs Sphéroblaste pas de PLPe Septalisation PLPs

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67 Implication pour le clinicien Temps dépendance –ATB bloque la synthèse du peptidoglycane –nagit que si la bactérie qui se multiplie –Le taux efficace doit être constant –Admisnistration répétées ou perfusion continue Dose dépendance –Mècanisme de bactéricidie indépendant de la division –Synthèse protéique (ribosome, ADN) –Bolus, dose élevée

68 Lipopolysaccharides of Gram- Negative Bacteria LPS, Endotoxine Base de la physiopathologie septique Déclenchement de la réaction inflammatoire Constituant de la paroi externe de tous les BGN Libération lors de la lyse de la bactérie

69 Le LPS : composant essentiel de la membrane externe des BGN Alexander, J Endotox Res 2001 Paroi dun BGN

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73 DOSAGE DU LPS Endotoxin Activity Assay Spectral diagnostics

74 Structure du LPS Chaîne O-terminale Jusquà 50 unités oligosaccharidiques répétées, formées de 2 à 8 monosaccharides. Haute variabilité donc spécifiques despèce et de de souche. Donne lieu à la classification sérologique des bactéries sauvages. Lipide A Structure relativement conservée entre les espèces. Disaccharide central, 2 groupements phosphate, 6 groupements acyl. Responsable de lactivité endotoxique du LPS.

75 Intérêt dun dosage du LPS Nombreux arguments impliquant le LPS dans la physiopathologie du sepsis: –LPS est un des plus puissants immunostimulants connus parmi les composants de la paroi bactérienne –LPS in vitro sur des cellules immunitaires induit la modification de lexpression de + de 300 gènes –LPS in vitro sur des cellules immunitaires induit la production des cytokines impliquées dans la physiopathologie du sepsis –LPS iv reproduit la plupart des manifestations observées au cours du sepsis (fièvre, frissons, hyperleucocytose, thrombopénie, coagulopathie,…) –Absence de LBP, CD14 ouTLR4 chez lanimal, qui sont impliqués dans la reconnaissance du LPS, les protègent contre un choc septique par des BGN

76 Dosage du LPS par le LAL en clinique Pathologies non septiques : –Cirrhose, transplantation hépatique, hépatite, pancréatite : nombreuses études +, gradient porto-systémique en LPS –Choc hémorragique –Chirurgie cardiaque ou vasculaire –Coureurs de marathon nauséeux … Translocation à partir du TD Pathologies septiques : –LPS + dans 20-40% des cas de sepsis –LPS + dans 20-55% des sepsis à BGN qqsoit site –LPS + dans 53-79% des bactériémies à BGN –Mais LPS également + dans 10-50% des bactériémies à CGP –Se = 50-55%, VPP = 40-50% pour bactériémie à BGN (Hurley, J Clin Microbiol 1994, Meta-analyse) Corrélation à loutcome : –OUI dans la méningococcémie ou bactériémies à BGN (OR 6.3) –PAS de corrélation sinon

77 Patients à investiguer Sepsis qq soit germe Etat de choc non septique avec ischémie reperfusion (cardiogénique, hémorragique) : translocation Valider le diagnostic de choc septique Homogénéiser les patients dans les protocoles ! Prix dun dosage = 25 euros

78 Les délais

79 Examen direct Transport Acheminement Technique < 1 heure

80 Examen macro 5 min

81

82 Etat frais examen direct PNN, cellules Bactéries, champignons mobilité

83 GRAM

84 KP

85 CG+amas

86 Cg+chaînette

87 amas

88 Bg+clostridium

89 coryne

90 actinomycete

91 aspergillus

92 cholera

93 candida

94 acineto

95 ALA test Haemophilus influenzae \ H parainfluenzae Bacitracin (A) disk group A β-hemolytic streptococci, Bile solubility pneumococci (lysé par la bile) Catalase staphylococci [catalase +], streptococci [catalase -]). Coagulase Staphylococcus aureus C+, S. epidermidis C- Indole Escherichia coli indol + Optochin identification of Streptococcus pneumoniae. Oxidase Enterobacteries : oxidase negative Pseudomonas : oxidase positive PYR hydrolysis Streptococcus pyogenes, Enterococcus sp.,

96 ECBU E. coli 2 heures

97 E. coli 24 heures

98 antibiogramme GRAM

99 ATBgramme 48 heures

100 men

101

102

103 pyo

104 oxydase

105 ATBgramme pyo

106 pneumo

107 pneum

108 pneu

109 KPhc

110 kp

111

112 staph

113

114

115 listeria

116 Pathogénécité agent pathogène –Endotoxine –Exotoxine Comment et pourquoi un germe de la flore normale (commensale) devient pathogène ? Les conditions de réanimation –Actes invasifs –Intervention, inflammation –ATB –Rupture des barrières –Altération de léquilibre des flores

117

118 Habitat habituel des BGN Tube digestifPeauPliMuqueuses E. colinormal±±+ KESnormal+ Citrobacter sp.normal+ Proteus sp.normal±+ Salmonella sp.anormal Yersinia sp.anormal Acinetobacter sp.normal±±

119 Ecologie hospitalière des bacilles à Gram négatif (présence possible) (1) mainspeaupeauplis muqueuses saineléséemacération saines E. coli±± + + KES±±+ Proteus sp.±±+++ Acinetobacter sp.++++±

120 Ecologie hospitalière des bacilles à Gram négatif (présence possible) (2) muqueuseeaudispositifssurfacedésinfectants léséemédicauxpaillassesavon E. coli+±+± KES++±±++ Proteus sp.+± Acinetobacter sp.+±+++

121 Colonisation / infection Seuil > 10 5 CFU/ g de tissus ou mL De liquide normalement stérile Changement de flore cutanée –Vêtements –Douche, toilettes … Environnement Faute dhygiène

122 Identifier la bactérie responsable de linfection Symbiose –La bactérie sadapte à son envirronnement incluant les animaux et les humains ou elle réside et subsiste normallement. –La bactérie assure sa survie et se reproduit assurant sa descendance. Colonisation –micro-organismes résident sont en majorité inoffensifs –Essentiels pour lhomme photosynthesis, production de vitamines dans lintestin decomposition de la matière organique. Les vrais recycleurs de notre planète Pathogenicité –infection accidentelle à partir de bactéries qui infectent les animaux Salmonelle et campylobacter sont transmis par la nourriture. –Yersinia pestis, la peste –Bacillus anthracis (anthrax) viande crue et poils danimal infecté. – Clostridium species ubiquitaire de lenvirronnement transmis par ingestion ou contact, C perfringens gangrene gazeuse gastroenteritis and C botulinum [botulism]) C tetani

123 Pathogénicité Escherichia coli flore normale,intestin de lhomme mais aussi le germe responsable dinfections urinaires, diarrhée du touriste et dautre infections. Pourquoi cette souche est pathogène ?. –La virulence de cette souche est retrouvée chez lanimal –Linfection est reproductible in vitro –Génétiquement cette bactérie possède un marqueur associé au déclenchement de linfection. pseudomonas species, Stenotrophomonas maltophilia, et la majorité des levures ne provoquent des infections que chez les patients immunodépprimés ou débilités Opportunistes

124 Processus Infectieux : le pneumocoque –Cultivé à partir du nasopharynx de 5 à 40 % des sujets sains –Passage dans les poumons Coma Abolition des reflexes… –Multiplication dans les alvéoles Pas danticorps contre la capsule polysaccharridique de cette souche –Passage dans les lymphatiques et le sang Pneumopathie Méningite Endocardite Arthrite….

125 Postulat de Koch Lagent responsable dune maladie doit répondre au postulat de Koch –agent présent chez tous les individus présentant la pathologie –Agent pouvant être cultivé –Agent qui lorsquil est introduit chez lhôte ou dans un modèle sen rapprochant induit le développement de la pathologie –Possibilité de réisoler lagent à partir dun animal présentant la pathologie

126 Exotoxines Produites par les G+ et les G- C. diphtheria –Muqueuses ORL et plaies cutanés –Bactériophage –diphtérie C tetani, C botulinum –Sol, eau, multiplication si anaérobiose –Toxine absorbé par lintestin –Membrane pré synaptique des motoneurones des nerfs périphériques et nerfs crâniens –Inhibe la libération de lacetylcholine –paralysie

127 Exotoxines C perfringens –Alpha toxin, lécithinase, collagénase, DNAse –Destruction des membranes S aureus –TSST 1, toxic shock syndrom Streptocoque β hémolytique A –Pyrogenic exotoxin A –Super antigène –scarlatine

128 Exotoxines associées aux diarhée et aux intoxications alimentaires V cholerae –pénétration par voie digestive –Se fixe aux microvillosités –2 sérotypes : O1 et O139 –Production de la toxine S aureus – enterotoxines déja présentes dans lalimentation –6 types denterotoxine de staphylocoque Y enterocolitica Vibrio parahaemolyticus Aeromonas species, C perfringens

129 Activité antimicrobienne in vitro Antibiogramme Dosage des antibiotiques (sang, tissus)

130 Définition de la résistance CA - SFM Sensible (S) : probabilité acceptable de succès thérapeutique si traitement par voie générale à dose habituelle (CMI<<>> C° sérique) Intermédiaire (I) : succès imprévisible (CMI proche C° sérique)

131 Résistance naturelle Caractéristique propre à une espèce bactérienne Partagée par toutes les souches normales de cette espèce Définit le phénotype sauvage ou sensible de cette espèce Référence pour établir le spectre dactivité des ATB (espèces habituellement sensible)

132 Résistance acquise Caractéristique de certaines souches au sein dune espèce bactérienne Résulte dune modification génétique –Mutation –Acquisition de matériel génétique étranger Définit des phénotypes résistants Fréquence prise en compte dans la nouvelle nomenclature du CA-SFM (espèces inconstamment sensibles)

133 Comité de lantibiogramme Antibiogramme : méthodes, doses … Données pharmacocinétiques Diamètre en fonction –Milieu de culture –Conditions de culture –Disque et C° –espèce

134 Supports de la résistance Chromosomique –Stable –Transmission verticale (descendance) –Épidémie de souches Plasmidique –Instable(cure si pas de pression de sélection) –Transmission verticale –Transmission horizontale –Épidémie de souches ou du support lui-même

135 La résitance bactérienne pour les cliniciens Il suffit de le savoir !!!!!!!!! Orientation diagnostique Terrain Infections hospitalières Antibiothérapie préalable Lantibiothérapie initiale doit tenir compte dune potentielle résistance bactèrienne Adapter au bout de 48 heures

136

137 Acquisition de résistance mutants résistants –Mutant : augmentation de la CMI –Apparition dun mécanisme de résistance –Modification de la séquence nucléotidique du gène responsable La sélection –Mutant présent dans la population sensible –Lantibiotique permet la sélection de ces mutants

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139 Facteurs favorisant la sélection La bactérie –Nombre détape mutationnelle –Proportion élevée de mutants –Bas niveau de résistance naturelle ou acquise Lantibiotique –Concentration locale comprise entre CMI/S et CMI / R –Bactéricidie sur les bactéries sensibles Foyer infectieux –Inoculum bactérien important –Site –Corps étranger

140 Prévention de la sélection Identifier les situations « à risque »(bactérie,ATB,foyer) Diminuer linoculum bactérien –Drainage –Premier antibiotique peu sélectionnant (oxacilline ou glycopeptide sur SA Posologie élevée Association dantibiotiques

141 Activité antimicrobienne in vivo Diffusion, distribution, métabolisme, et toxicité Relations drogue-pathogène –Diffusion au site de linfection Intra-cellulaire –Quinolones, tetracyvlines –Aminosides Anaérobie, tissus nécrotique, ischémie –Aminosides, quinolones –liposolubilité chloramphenicol, rifampin, trimethoprim, isoniazid imidazole Inoculum. pH du milieu Pus et tissus nécrotiques –Aminosides polymixines hémoglobine. Penicillins and tetracyclines

142 Le choix du bon antibiotique Identification de lagent infectant –GRAM, examen direct, PNN, … –Antigene, latex, PCR –bacteriologic statistics and epidemiology antibiogramme Facteurs liés à lhôte –allergie –Age – acidité gastrique reduit labsorption des peni, absorption du ketoconazole diminuée par les antiacides –tetracyclines. Fixation sur lémail dentaire – quinolone. Toxique pour les cartilages et ligaments –Anomalies Genetiques ou Metabolique (ISONIAZIDE acetyleur) –grossesse –Renal and Hepatic Function Corps étranger glycocalyx or biofilm,

143 glycocalyx

144 Mécanisme de bactéricidie Paroi bactérienne –Beta lactamines, glycopeptides Membrane cytoplasmique –Polymyxines Synthèse protéique –Aminosides, cyclines, macrolides, lincosamides, streptogramines, rifampicine, chloramphenicol, acide fusidique, triméthoprime-sulfaméthoxazole Réplication de lADN –Fluoroquinolones Inhibiteurs de beta-lactamases

145

146 OGM

147

148 Le microbe n'est rien. Le terrain est tout. »

149 Conclusion Apport majeur de lexamen direct Identification rapide et traitement adapté Confirmer le choc septique Essayer de limiter la diffusion de la résistance bactérienne Controle de lantibiothérapie

150 Merci de votre attention….

151 Et lavez vous bien les mains…


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