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CONTAMINANTS ALIMENTAIRES ET CIBLES CELLULAIRES Exemple des pesticides Laurence Gamet-Payrastre

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Présentation au sujet: "CONTAMINANTS ALIMENTAIRES ET CIBLES CELLULAIRES Exemple des pesticides Laurence Gamet-Payrastre"— Transcription de la présentation:

1 CONTAMINANTS ALIMENTAIRES ET CIBLES CELLULAIRES Exemple des pesticides Laurence Gamet-Payrastre

2 Des facteurs de risque pour la santé chez lhommeDes facteurs de risque pour la santé chez lhomme Mécanisme daction de la toxicité des pesticides :Les cibles cellulairesMécanisme daction de la toxicité des pesticides :Les cibles cellulaires Les approches en toxicologie cellulaire et moléculaireLes approches en toxicologie cellulaire et moléculaire

3 Les pesticides : généralités Définition toute substance naturelle ou de synthèse capable de contrôler, repousser ou détruire des organismes vivants ou de sopposer à leur développement. Produits phytosanitaires destinés à un usage agricole ou non agricole Classification selon leur activité biologique - les insecticides - les fongicides -les herbicides - les divers (nématicides, rodenticides, taupicides, etc…) Classification par famille chimique: - Composés organiques chlorés (DDT, Lindane, Aldrine, Dieldrine, etc.) - Composés organiques phosphorés (Parathion, Fenthion) - Composés organométalliques (Dérivés de lurée, carbamates, etc.) - pyréthrinoides de synthèse, triazine etc…. "

4 Usage agricole (90%) - 3 ième consommateur mondial de pesticides - 4 ième utilisateur européen (par hectare de surface cultivée ) Usage non agricole (10%) - traitement des parasites dans la maison - traitement des bois et textiles - soins des animaux - traitement des plantes dintérieurs, jardins, espaces verts Les pesticides : généralités

5 Exposition professionnelle Population définie 1.3 millions de personnes professionnellement exposées en France (X2 avec les retraités) Molécules définies Temps dexposition défini Exposition non professionnelle 80% via lalimentation Les pesticides : généralités Exposition alimentaire - -Mélange de résidus - -long terme - -Faibles doses

6 Lexposition professionnelle aux pesticides, et en particulier chez les agriculteurs, est souvent corrélée à un risque accru de troubles de la santé - Certains cancers (hématopoïétique, cerveau, prostate) - Certaines maladies neuro-dégénératives comme la maladie de Parkinson - - Certaines déficiences au niveau du développement cérébral - - Des troubles de limmunité - - Des troubles de la reproduction - - Des perturbations endocriniennes Études épidémiologiques dans les populations professionnellement exposées Les pesticides : des facteurs de risques

7 Les cancers hématopoïétiques tumeurs du cerveau, des troubles au niveau du système nerveux central (développement cérébral, neuro-comportement) ou de limmunité Exposition professionnelle des parents pendant la période prénatale associées à diverses pathologies chez les enfants Les pesticides : des facteurs de risques

8 Certains pesticides, sont capables dinduire in vitro dans des cellules humaines des perturbations du fonctionnement cellulaire Les pesticides : des facteurs de risques

9 Cibles cellulaires des pesticides Elimination du conjugué les systèmes de détoxification xénobiotiques Mort cellulaire programmée Transduction du signal Statut oxydo-réducteur la génotoxicité La régulation de la prolifération de la survie

10 Elimination du conjugué les systèmes de détoxification pesticides la génotoxicité REPARATION ADN Ralentissement du cycle cellulaire Système dexcision et réparation des dommages Système enzymatique de réparations des cassures Les différents dommages à lADN sont: les bases oxydées (8oxodG), les coupures simples et doubles brins, les adduits à lADN Dans les lymphocytes dagriculteurs on observe une augmentation des cassures simples et doubles brins de lADN (MN) (Tope A. et al, 2006) Augmentation des adduits à lADN dans le sang périphériques des agriculteurs (J. Le Goff,,2005) Dans les cellules RTG2, lalachlore induit des cassures dADN (Parra JM, 2010) lésions spontanées / jour/ cellule Cibles cellulaires des pesticides

11 Elimination du conjugué les systèmes de détoxification xénobiotiques mutation RNA, Protéines Cellule transformée Stimulation de la prolifération de la cellule transformée Promotion tumeur Accumulation danomalies génétiques définitives dans des gènes contrôlant la survie et la prolifération Initiation Conséquence de la génotoxicité des pesticides ? Réparation de l ADN Ils peuvent affecter la structure du DNA et donc la transcription de gènes importants ils peuvent conduire à des mutations qui affecteront la survie ou la capacité de prolifération des cellules. Cibles cellulaires des pesticides

12 Elimination du conjugué les systèmes de détoxification xénobiotiques mutation Réparation de l ADN Cellules transformées initiation promotion tumeur ARN Protéines Mort cellulaire programmée Ex Methoxychlor induit une atrophie du thymus via linduction de lapoptose dans les thymocytes., 2010 Fukuyama T, 2010 Cibles cellulaires des pesticides conséquence de la génotoxicité : apoptose

13 mort cellulaire programmée apoptose Processus physiologique de régulation du nombre de cellules Au cours du développement embryonnaire, Dans la défense immunitaire Pour le renouvellement des cellules du tractus digestif Cibles cellulaires des pesticides conséquence de la génotoxicité : apoptose

14 Le phénomène d'apoptose « mort cellulaire programmée » modifications structurales Plusieurs étapes en cascade, dont les effets sont visualisables dans les cellules : –flip-flop de la phosphatidyl-sérine du feuillet cytosolique au feuillet extracellulaire de la membrane plasmique –Boursouflure membranaire –fragmentation de l'ADN nucléaire –fragmentation du cytoplasme, formation des corps apoptotiques

15 Apoptose Modifications biochimiques P53 Independent pathways Ca++ Modification de la répartition des phospholipides membranaires Hydrolase Cytosolique inactives Hydrolase Cytosolique actives P53 Dependent pathways Lésions irréversibles des protéines cytosoliques Le paraoxon modifie le potentiel mitochondrial transmembranaire des cellules leucémiques EL4 T, induit la libération du cytochrome c dans le cytosol et lactivation conséquentes des caspases (Saleh AM et al, 2003). le paraquat dichloride, un herbicide,induit lapoptose via linduction de P53 (Takeyama N, et al, 2004) Le diazinon active lapoptose via lactivation des caspases dans les cellules de teratocarcinome humain (Aluigi MG, 2010) Hydrolyze des enzymes de réparation de l'ADN (PARP) Et des enzymes de structure : gelsoline lamine Fragmentation de l'ADN Cascade d'activation d'enzymes APAF-1 : apoptosis protease activating factor-1 ; CAD : caspase-activated internucleosomal DNAse ; IAP : inhibitors of apoptosis proteases ; PARP : poly(ADP- ribose) polymerase ; pro-CASP-9 : précurseur inactif de la caspase initiatrice CASP-9. Cibles cellulaires des pesticides conséquence de la génotoxicité : apoptose

16 la toxicité dun xénobiotique peut être due à une variation du statut oxydo-réducteur de la cellule Cibles cellulaires des pesticides

17 Statut oxydo-réducteur : définition ROS espèces oxygénées réactives Echec régulation statut redox Stress oxydant Attaque lipide, DNA, protéines O2 Chaine mitochondriale Inflammation Défenses cellulaires PROTECTION Initiation Promotion: expansion clonale Croissance et Instabilité génétique tumeur Dégâts cellulaires Mutation DNA apoptose Réparation DNA Systèmes enzymatiques (SOD, catalase, glutathion peroxydase) glutathion Anti-oxydants vit E, C cytoP450 Facteurs environnementaux Radiation, ozone, hyperoxie, xénobiotiques Radicaux primaires dérivent de loxygène (OH., O2., NO.) jouent un rôle cellulaire dans : défense, cycle cellulaire, différenciation, mort cellulaire, transduction des signaux Cibles cellulaires des pesticides

18 Exemple deffet pro-oxydant des pesticides Dans les follicules ovariens isolés, le methoxychlore entraine une diminution des activités enzymatiques régulant le statut oxydo-réducteur (SOD, catalase, super-oxyde dismutase) et modifie lactivité respiratoire des mitochondries. Gupta RK et al, 2006 Le malathion (OP) inhibe lactivité des enzymes de régulation du stress oxydant, diminue la production dATP et altère la matrice mitochondriale. Delgado EHB et al, Le traitement des rats avec du chlorpyrifos (insecticide, OP) conduit à une diminution des activité des enzymes du type SOD, catalase, à une déplétion en glutathion intracellulaire dans le foie, le rein et le cerveau des animaux traités avec 100mg/kg; (forte dose). Verma RS et al, Enantioselective cytotoxicity of isocarbophos is mediated by oxidative stress-induced JNK activation in human hepatocytes. Liu H, Liu J, Xu L, Zhou S, Li L, Liu W. Toxicology Enantioselective cytotoxicity of isocarbophos is mediated by oxidative stress-induced JNK activation in human hepatocytes. Hydrogen peroxide induced by the fungicide prothioconazole triggers deoxynivalenol (DON) production by Fusarium graminearum. Audenaert K, Callewaert E, Höfte M, De Saeger S, Haesaert G. BMC Microbiol. 2010Hydrogen peroxide induced by the fungicide prothioconazole triggers deoxynivalenol (DON) production by Fusarium graminearum. Pentachlorophenol and its derivatives induce oxidative damage and morphological changes in human lymphocytes (in vitro). Michałowicz J.Arch Toxicol. 2010Pentachlorophenol and its derivatives induce oxidative damage and morphological changes in human lymphocytes (in vitro). Oxidative stress induced by loss of Cu,Zn-superoxide dismutase (SOD1) or superoxide-generating herbicides causes axonal degeneration in mouse DRG cultures.Fischer LR, Glass JD. Acta Neuropathol. 2010Oxidative stress induced by loss of Cu,Zn-superoxide dismutase (SOD1) or superoxide-generating herbicides causes axonal degeneration in mouse DRG cultures. Cibles cellulaires des pesticides

19 Elimination du conjugué les systèmes de détoxification xénobiotiques Mort cellulaire programmée Transduction du signal Statut oxydo-réducteur la génotoxicité La régulation de la survie de la prolifération Cibles cellulaires des pesticides La transduction du signal

20 Tout processus qui convertit un type de signal ou un stimulus vers une réponse cellulaire via une succession dévènements biochimiques (de phosphorylation et de déphosphorylation) dans lesquels interviennent de nombreuses enzymes (kinase/phosphatase) i.e. les intermédiaires de la signalisation Cascade de phosphorylation déphosphorylation La transduction du signal peut se faire soit via - - La liaison de molécules sur des récepteurs membranaires ou intracellulaires - - Un stimulus « physique » (lumière/cellules de la rétine) - - L interaction directe dune molécule (xénobiotiques) avec les intermédiaires de la signalisation Réponse cellulaire, survie, prolifération, mort cellulaire, différenciation Cibles cellulaires des pesticides

21 Les intermédiaires Les pesticides organochlorés (endosulfan, lindane) active la voie des MAP kinases (raf MEK et ERK) ainsi que la transcription de c-Jun. Ledirac N et al, Lisocarbophos, un organophosphoré, induit la production de ROS, lactivation de la voie dépendante de la JNK et lapoptose dans les cellules HepG2. Liu H, 2010 Cibles cellulaires des pesticides La phosphorylation et la déphosphorylation modulent l'activité de certains facteurs de transcription : en les activant directement (exemple : facteur AP-1) en modifiant leur localisation cellulaire (exemple : facteurs NFkB et NFAT)

22 Elimination du conjugué les systèmes de détoxification xénobiotiques Mort cellulaire programmée Transduction du signal Statut oxydo-réducteur la génotoxicité La régulation de la prolifération de la survie Toxicologie cellulaire et moléculaire Les approches Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire

23 Estimation de la viabilité MTT sels de tetrazolium converti par les deshydrogenases mitochondriales actives en formazan (absorbance 570nm) Comptage cellulaire comptage des cellules flottant dans le milieu de culture et comptage des cellules adhérentes Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire

24 Génotoxicité Comet assay mesure des cassures simples et doubles brins induites - - directement par un agent génotoxique, - - indirectement lors des processus enzymatiques de réparation des dommages - - lors de processus secondaires de fragmentation de lADN tel que lapoptose. - Principe : électrophorèse en gel dagarose de noyaux marqués avec un agent fluorescent. Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire les noyaux dont lADN a subi des cassures prennent une forme de comète et les noyaux dont lADN nest pas endommagé restent ronds

25 Stress oxydant Taux de ROS nombreuses sondes fluorescentes réactives avec les radicaux libres Mesure de lactivité des enzymes régulant le stress oxydant - SuperOxyde Dismutase (SOD): 2 O2° + 2 H2 H2O2 + O2 - Catalase: 2H2O2 2 H2O + O2 - Glutathion peroxydase: H2O2 + 2 GSH 2 H2O + GS-SG Dosage des taux de glutathion Dosage des marqueurs périphérique doxydation (8oxodg dans le plasma; détection des bases ou nucléotides modifiés par chromatographie liquide haute perf. (HPLC) + Spectrométrie de masse (MS) Mise en évidence marqueurs cellulaires de peroxidation lipidique (HNE (4- hydroxy -2-nonenal; MDA malonyldialdehyde) utilisation danticorps Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire

26 Signalisation cellulaire Western blot : migration de protéines dans un gel dénaturant en fonction de leur poids moléculaires : identifier une protéine spécifique dans un extrait cellulaire Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire

27 Arrays (Protein) antibody-array : visualiser et quantifier lexpression de plusieurs protéines dun même extrait cellulaire Plateforme Biopuces Génopôle Toulouse Midi Pyrénées Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : signalisation cellulaire

28 Incorporation de iodure de propidium dans les noyaux et analyse de la quantité de fluorescence qui est le reflet de la quantité dADN Sub G0/G1Cellules apoptotiques G1 G2/M Cytométrie en flux Double marquage iodure de propidium/ lanexine-fluorescéine Dans les cellules apoptotiques les phosphatidyl serine membranaires sont à lextérieur et peuvent fixer lanexine. Les membranes ne sont pas perforées et liodure de propidium ne pénètre pas. Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : apoptose

29 DNA Ladder migration de lADN sur gel dagarose. Il apparaitra sous forme de petit fragments (échelle) le long du gel dans le cas de cellules apoptotiques sinon on ne voit quune seule bande. Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : apoptose

30 Mesure de lactivité des caspases effectrices (3) Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : apoptose

31 conclusion Les pesticides affectent différentes cibles qui contrôlent la croissance et la survie des cellules humaines. Ces effets sont observés pour des molécules testées individuellement Quen est-il de leffet des mélanges et des faibles doses


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