CONTAMINANTS ALIMENTAIRES Exemple des pesticides

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1 CONTAMINANTS ALIMENTAIRES Exemple des pesticides
ET CIBLES CELLULAIRES Exemple des pesticides Laurence Gamet-Payrastre

2 Des facteurs de risque pour la santé chez l’homme
Mécanisme d’action de la toxicité des pesticides :Les cibles cellulaires Les approches en toxicologie cellulaire et moléculaire

3 Les pesticides : généralités
● Définition toute substance naturelle ou de synthèse capable de contrôler, repousser ou détruire des organismes vivants ou de s’opposer à leur développement. Produits phytosanitaires destinés à un usage agricole ou non agricole ● Classification selon leur activité biologique - les insecticides - les fongicides -les herbicides - les divers (nématicides, rodenticides, taupicides, etc…) ● Classification par famille chimique: - Composés organiques chlorés (DDT, Lindane, Aldrine, Dieldrine, etc.) - Composés organiques phosphorés (Parathion, Fenthion) - Composés organométalliques (Dérivés de l’urée, carbamates, etc.)  - pyréthrinoides de synthèse, triazine etc…. "

4 Les pesticides : généralités
Usage agricole (90%) - 3 ième consommateur mondial de pesticides - 4 ième utilisateur européen (par hectare de surface cultivée ) Usage non agricole (10%) - traitement des parasites dans la maison - traitement des bois et textiles - soins des animaux - traitement des plantes d’intérieurs, jardins, espaces verts

5 Les pesticides : généralités
Exposition professionnelle Population définie 1.3 millions de personnes professionnellement exposées en France (X2 avec les retraités) Molécules définies Temps d’exposition défini Exposition non professionnelle 80% via l’alimentation Exposition alimentaire Mélange de résidus long terme Faibles doses

6 Les pesticides : des facteurs de risques
Études épidémiologiques dans les populations professionnellement exposées L’exposition professionnelle aux pesticides, et en particulier chez les agriculteurs, est souvent corrélée à un risque accru de troubles de la santé - Certains cancers (hématopoïétique, cerveau, prostate) - Certaines maladies neuro-dégénératives comme la maladie de Parkinson Certaines déficiences au niveau du développement cérébral Des troubles de l’immunité Des troubles de la reproduction Des perturbations endocriniennes

7 Les pesticides : des facteurs de risques
Exposition professionnelle des parents pendant la période prénatale associées à diverses pathologies chez les enfants Les cancers hématopoïétiques tumeurs du cerveau, des troubles au niveau du système nerveux central (développement cérébral, neuro-comportement) ou de l’immunité

8 Les pesticides : des facteurs de risques
Certains pesticides, sont capables d’induire in vitro dans des cellules humaines des perturbations du fonctionnement cellulaire

9 Cibles cellulaires des pesticides
Elimination du conjugué Statut oxydo-réducteur Transduction du signal La régulation de la prolifération de la survie xénobiotiques la génotoxicité les systèmes de détoxification Mort cellulaire programmée

10 Cibles cellulaires des pesticides
Elimination du conjugué la génotoxicité Dans les lymphocytes d’agriculteurs on observe une augmentation des cassures simples et doubles brins de l’ADN (MN) (Tope A. et al, 2006) Augmentation des adduits à l’ADN dans le sang périphériques des agriculteurs (J. Le Goff, ,2005) Dans les cellules RTG2, l’alachlore induit des cassures d’ADN (Parra JM, 2010) pesticides les systèmes de détoxification Les différents dommages à l’ADN sont: les bases oxydées (8oxodG), les coupures simples et doubles brins, les adduits à l’ADN REPARATION ADN Ralentissement du cycle cellulaire Système d’excision et réparation des dommages Système enzymatique de réparations des cassures lésions spontanées / jour/ cellule

11 Cibles cellulaires des pesticides
Elimination du conjugué Ils peuvent affecter la structure du DNA et donc la transcription de gènes importants ils peuvent conduire à des mutations qui affecteront la survie ou la capacité de prolifération des cellules. Réparation de l ’ADN RNA, Protéines xénobiotiques les systèmes de détoxification mutation Accumulation d’anomalies génétiques définitives dans des gènes contrôlant la survie et la prolifération Initiation Conséquence de la génotoxicité des pesticides ? Cellule transformée Stimulation de la prolifération de la cellule transformée Promotion tumeur

12 Mort cellulaire programmée
Cibles cellulaires des pesticides conséquence de la génotoxicité : apoptose Elimination du conjugué Réparation de l ’ADN Protéines ARN xénobiotiques mutation les systèmes de détoxification Cellules transformées initiation Mort cellulaire programmée Ex Methoxychlor induit une atrophie du thymus via l’induction de l’apoptose dans les thymocytes. Fukuyama T, 2010 promotion tumeur

13 mort cellulaire programmée apoptose
Cibles cellulaires des pesticides conséquence de la génotoxicité : apoptose mort cellulaire programmée apoptose Processus physiologique de régulation du nombre de cellules ■ Au cours du développement embryonnaire, ■ Dans la défense immunitaire ■ Pour le renouvellement des cellules du tractus digestif

14 Le phénomène d'apoptose « mort cellulaire programmée »  modifications structurales
Plusieurs étapes en cascade, dont les effets sont visualisables dans les cellules : flip-flop de la phosphatidyl-sérine du feuillet cytosolique au feuillet extracellulaire de la membrane plasmique Boursouflure membranaire fragmentation de l'ADN nucléaire fragmentation du cytoplasme , formation des corps apoptotiques

15 Cibles cellulaires des pesticides conséquence de la génotoxicité : apoptose
Le paraoxon modifie le potentiel mitochondrial transmembranaire des cellules leucémiques EL4 T, induit la libération du cytochrome c dans le cytosol et l’activation conséquentes des caspases (Saleh AM et al, 2003). le paraquat dichloride, un herbicide,induit l’apoptose via l’induction de P53 (Takeyama N, et al, 2004) Le diazinon active l’apoptose via l’activation des caspases dans les cellules de teratocarcinome humain (Aluigi MG, 2010) Apoptose Modifications biochimiques P53 Independent pathways P53 Dependent pathways Modification de la répartition des phospholipides membranaires Ca++ Hydrolase Cytosolique inactives actives Hydrolyze des enzymes de réparation de l'ADN (PARP) Et des enzymes de structure : gelsoline lamine Fragmentation de l'ADN Cascade d'activation d'enzymes Lésions irréversibles des protéines cytosoliques APAF-1 : apoptosis protease activating factor-1 ; CAD : caspase-activated internucleosomal DNAse ; IAP : inhibitors of apoptosis proteases ; PARP : poly(ADP-ribose) polymerase ; pro-CASP-9 : précurseur inactif de la caspase initiatrice CASP-9.

16 Cibles cellulaires des pesticides
la toxicité d’un xénobiotique peut être due à une variation du statut oxydo-réducteur de la cellule

17 Cibles cellulaires des pesticides
Statut oxydo-réducteur : définition Stress oxydant Attaque lipide, DNA, protéines Dégâts cellulaires Mutation DNA apoptose Facteurs environnementaux Radiation, ozone, hyperoxie, xénobiotiques O2 mitochondriale Chaine Echec régulation statut redox Réparation DNA Initiation Promotion: expansion clonale Croissance et Instabilité génétique tumeur Radicaux primaires dérivent de l’oxygène (OH., O2., NO.) jouent un rôle cellulaire dans : défense, cycle cellulaire, différenciation, mort cellulaire, transduction des signaux ROS espèces oxygénées réactives cytoP450 Inflammation Défenses cellulaires PROTECTION Systèmes enzymatiques (SOD, catalase, glutathion peroxydase) glutathion Anti-oxydants vit E, C

18 Exemple d’effet pro-oxydant des pesticides
Cibles cellulaires des pesticides Exemple d’effet pro-oxydant des pesticides Dans les follicules ovariens isolés, le methoxychlore entraine une diminution des activités enzymatiques régulant le statut oxydo-réducteur (SOD, catalase, super-oxyde dismutase) et modifie l’activité respiratoire des mitochondries. Gupta RK et al, 2006 Le malathion (OP) inhibe l’activité des enzymes de régulation du stress oxydant , diminue la production d’ATP et altère la matrice mitochondriale. Delgado EHB et al, 2006. Le traitement des rats avec du chlorpyrifos (insecticide, OP) conduit à une diminution des activité des enzymes du type SOD, catalase, à une déplétion en glutathion intracellulaire dans le foie , le rein et le cerveau des animaux traités avec 100mg/kg; (forte dose). Verma RS et al, 2007. Enantioselective cytotoxicity of isocarbophos is mediated by oxidative stress-induced JNK activation in human hepatocytes. Liu H, Liu J, Xu L, Zhou S, Li L, Liu W. Toxicology Hydrogen peroxide induced by the fungicide prothioconazole triggers deoxynivalenol (DON) production by Fusarium graminearum. Audenaert K, Callewaert E, Höfte M, De Saeger S, Haesaert G. BMC Microbiol. 2010 Pentachlorophenol and its derivatives induce oxidative damage and morphological changes in human lymphocytes (in vitro). Michałowicz J.Arch Toxicol. 2010 Oxidative stress induced by loss of Cu,Zn-superoxide dismutase (SOD1) or superoxide-generating herbicides causes axonal degeneration in mouse DRG cultures.Fischer LR, Glass JD. Acta Neuropathol. 2010

19 Cibles cellulaires des pesticides
Elimination du conjugué Statut oxydo-réducteur Transduction du signal La régulation de la survie de la prolifération xénobiotiques la génotoxicité les systèmes de détoxification Mort cellulaire programmée La transduction du signal

20 Cibles cellulaires des pesticides
La transduction du signal Tout processus qui convertit un type de signal ou un stimulus vers une réponse cellulaire via une succession d’évènements biochimiques (de phosphorylation et de déphosphorylation) dans lesquels interviennent de nombreuses enzymes (kinase/phosphatase) i.e. les intermédiaires de la signalisation La transduction du signal peut se faire soit via La liaison de molécules sur des récepteurs membranaires ou intracellulaires Un stimulus « physique » (lumière/cellules de la rétine) L ’interaction directe d’une molécule (xénobiotiques) avec les intermédiaires de la signalisation Cascade de phosphorylation déphosphorylation Réponse cellulaire, survie, prolifération, mort cellulaire, différenciation

21 Cibles cellulaires des pesticides
Les pesticides organochlorés (endosulfan, lindane) active la voie des MAP kinases (raf MEK et ERK) ainsi que la transcription de c-Jun. Ledirac N et al, 2005. L’isocarbophos, un organophosphoré, induit la production de ROS, l’activation de la voie dépendante de la JNK et l’apoptose dans les cellules HepG2. Liu H, 2010 La phosphorylation et la déphosphorylation modulent l'activité de certains facteurs de transcription : en les activant directement (exemple : facteur AP-1) en modifiant leur localisation cellulaire (exemple : facteurs NFkB et NFAT) Les intermédiaires

22 Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire
Elimination du conjugué Statut oxydo-réducteur Transduction du signal La régulation de la prolifération de la survie xénobiotiques la génotoxicité les systèmes de détoxification Mort cellulaire programmée Toxicologie cellulaire et moléculaire Les approches

23 Estimation de la viabilité
Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire Estimation de la viabilité MTT sels de tetrazolium converti par les deshydrogenases mitochondriales actives en formazan (absorbance 570nm) Comptage cellulaire comptage des cellules flottant dans le milieu de culture et comptage des cellules adhérentes

24 Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire
Génotoxicité Comet assay mesure des cassures simples et doubles brins induites directement par un agent génotoxique, indirectement lors des processus enzymatiques de réparation des dommages lors de processus secondaires de fragmentation de l’ADN tel que l’apoptose. - Principe : électrophorèse en gel d’agarose de noyaux marqués avec un agent fluorescent. les noyaux dont l’ADN a subi des cassures prennent une forme de comète et les noyaux dont l’ADN n’est pas endommagé restent ronds

25 Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire
Stress oxydant Taux de ROS nombreuses sondes fluorescentes réactives avec les radicaux libres Mesure de l’activité des enzymes régulant le stress oxydant - SuperOxyde Dismutase (SOD): 2 O2° + 2 H→2 H2O2 + O2 - Catalase: 2H2O2→ 2 H2O + O2 - Glutathion peroxydase: H2O2 + 2 GSH→ 2 H2O + GS-SG Dosage des taux de glutathion Dosage des marqueurs périphérique d’oxydation (8oxodg dans le plasma; détection des bases ou nucléotides modifiés par chromatographie liquide haute perf. (HPLC) + Spectrométrie de masse (MS) Mise en évidence marqueurs cellulaires de peroxidation lipidique (HNE (4-hydroxy -2-nonenal; MDA malonyldialdehyde) utilisation d’anticorps

26 Signalisation cellulaire
Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire Signalisation cellulaire Western blot : migration de protéines dans un gel dénaturant en fonction de leur poids moléculaires : identifier une protéine spécifique dans un extrait cellulaire

27 Génopôle Toulouse Midi Pyrénées
Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : signalisation cellulaire Arrays (Protein) antibody-array : visualiser et quantifier l’expression de plusieurs protéines d’un même extrait cellulaire Plateforme Biopuces Génopôle Toulouse Midi Pyrénées

28 Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : apoptose
Sub G0/G1Cellules apoptotiques G1 G2/M Cytométrie en flux Incorporation de iodure de propidium dans les noyaux et analyse de la quantité de fluorescence qui est le reflet de la quantité d’ADN Double marquage iodure de propidium/ l’anexine-fluorescéine Dans les cellules apoptotiques les phosphatidyl serine membranaires sont à l’extérieur et peuvent fixer l’anexine. Les membranes ne sont pas perforées et l’iodure de propidium ne pénètre pas .

29 Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : apoptose
DNA Ladder migration de l’ADN sur gel d’agarose. Il apparaitra sous forme de petit fragments (échelle) le long du gel dans le cas de cellules apoptotiques sinon on ne voit qu’une seule bande.

30 Mesure de l’activité des caspases effectrices (3)
Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : apoptose Mesure de l’activité des caspases effectrices (3)

31 conclusion Les pesticides affectent différentes cibles qui contrôlent la croissance et la survie des cellules humaines. Ces effets sont observés pour des molécules testées individuellement Qu’en est-il de l’effet des mélanges et des faibles doses