La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

Etude du protocole du TP2 Généralités sur les intégrines Sylvie Monferran.

Présentations similaires


Présentation au sujet: "Etude du protocole du TP2 Généralités sur les intégrines Sylvie Monferran."— Transcription de la présentation:

1 Etude du protocole du TP2 Généralités sur les intégrines Sylvie Monferran

2 Etude du protocole du TP2 4 manips / 3 jours qui se chevauchent TP: projet de recherche… autonomie Compte-rendu sous forme dun article scientifique –Résumé: à faire à la fin –Introduction: sur les intégrines –Matériels et méthodes: principe de chaque expérience –Résultats et discussion: critique des résultats –Conclusion et perspectives

3 Adhérence cellulaire Adhérence intercellulaire Adhérence homotypique: interaction entre cellules du même type cellulaire Adhérence hétérotypique: interaction entre cellules de type cellulaire différents Adhérence cellulaire à la matrice extracellulaire Nature Review in Molecular Cell Biology Extracellular matrix

4 Molécules dadhérence cellulaire Frenett et al, N Engl J Med, 1996 Ca2+ dépendantes: cadhérines, sélectines, intégrines Ca2+ indépendantes: CAM

5 Intégrines: récepteurs de la matrice extracellulaire Lame basaleMatrice interstitielle

6 Famille des intégrines Hynes, Cell, sous-unités 18 sous-unités 24 intégrines Liaison à un ligand matricielLiaison à un CAM

7 Spécificité des ligands des intégrines beta1 Ligands alpha1Collagens, Laminins alpha2Collagens, Laminins alpha3 Laminins, Fibronectin, Thrombospondin alpha4 Fibronectin, VCAM alpha5Fibronectin alpha6 Laminins alpha7 Laminins alpha8Fibronectin, Tenascin alpha9Tenascin alpha10 Collagens alpha11Collagens alphavFibronectin, Vitronectin beta2 alphaLICAMs alphaMFibrinogen, ICAMs, iC3b alphaXFibrinogen, ic3B alphaDVCAM, ICAMs beta3 alphaIIb Collagens, Fibronectin, Vitronectin, Fibrinogen, Von willebrand factor, Thrombospondin alphav Fibronectin, Vitronectin, Fibrinogen, Von willebrand factor, Thrombospondin alpha6Laminins beta5 alphavVitronectin beta6 alphavFibronectin, Tenascin beta7 alpha4Fibronectin, VCAM, MAdCAM alphaE E-cadherin beta8 alphavCollagens, Laminins, Fibronectin

8 Structure des intégrines Chaîne Domaine I/A (vWA) Membrane plasmique Sept domaines répétés en hélices Liaison à un cation (Ca2+) MIDAS Zone dinteraction avec le ligand Humphries, Biochemical Society, 2000 Domaine transmembranaire: Ancrage dans la membrane plasmique Domaine cytoplasmique: Interaction avec protéines de signalisation et du cytosquelette via la sous-unité Domaine extracellulaire: Interaction avec le ligand

9 Activation des intégrines Hynes, Cell, Activation par lextérieur de la cellule: liaison au ligand Signalisation outside-in Conformation inactive (recourbée) Conformation active: Liaison avec le ligand

10 Activation des intégrines -Activation par lintérieur de la cellule: liaison à des partenaires protéiques Signalisation inside-out Qin, Plos biology, 2004 Tadokoro, Science, 2003 Liaison des CHO exprimant IIb 3 à PAC-1 PAC-1: anticorps mimant la liaison de lintégrine IIb 3 au ligand LIBS6: anticorps activant lintégrine IIb 3 par lextérieur

11 Signalisation des intégrines Hood et Cheresh, Nat Rev Cancer, 2002 Activité enzymatique Kinases: FAK, PKC GTPases Rho: Rac, ras Protéines adaptatrices GRB2, CAS Protéines effectrices MLCK = MAPK Sos RAS GTP GDP P P = MEKK

12 Signalisation des intégrines: la FAK Structure et activation: KO FAK: Léthalité embryonnaire à J8 Défaut de migration des cellules du mésoderme Ilic et al, Nature, 1995 Vidéomicroscopie sur des « fibroblastes » dembryons de J8 FAK +/+FAK -/- Activation de FAK aux points de contact cellule/matrice extracellulaire: Cônes de croissance chez le Xénope Robles and Gomez, Nat Neuroscience, 2006

13 Liaison au cytosquelette dactine sauf lintégrine 6 4 qui se lie aux filaments intermédiaires Adhérence Migration Delon et al, Current Opinion in Cell Biology, 2007 Points focaux dadhérence: plus de 50 protéines identifiées Protéines liant lactine et permettant la stabilisation des filaments dactine pré- existants Taline, parvine… Nucléation de nouveaux filaments dactine Arp 2/3, formine… Actine/ myosine

14 Fonction des intégrines Prolifération cellulaire Survie cellulaire Contrôle de la transcription Matrice extracellulaire Hynes, Cell, 2002 Migration cellulaire Réorganisation du cytosquelette Intégrine 3 1 empêche la migration des kératinocytes murins (MK) Margadant, JCS, 2009 Test de migration Explants de peau Epiderme Derme

15 Pathologies associées aux intégrines (1) LAD (leukocyte adhesion deficiency): -défaut de recrutement aux sites dinfection des monocytes ou des neutrophiles -mutations dans le gène codant pour la sous-unité 2 des intégrines: LAD I -inhibition de lexpression de 2: LADI -ou expression dune forme de 2 qui nest pas présente à la membrane plasmique ou ne peut pas conduire le signal : LAD I variant Bunting, Curr Opinion Hematol, 2002

16 Pathologies associées aux intégrines (2) Cancers: - Changement de localisation subcellulaire ex: lintégrine 6 4 (marquage en jaune) dans une lignée de carcinome squameux Bello, Neurosurgery, Changement du répertoire des intégrines (inhibition des intégrines qui maintiennent les cellules attachées à la membrane basale et expression des intégrines qui permettent invasion,..) Ex: lintégrine v 3 exprimée dans les glioblastomes (GBM) mais pas dans le cerveau sain (NB) Intégrine v 3 Cerveau sain Glioblastome Rabinovitz, JCB, 1999

17 Régulation des voies de signalisation des intégrines par dautres récepteurs Guo, Nat Rev Mol Cell Biol, 2004

18 Guo, Cell, 2006 IP Signalisation 4 Acini mammaire Signalisation croisée entre lintégrine 6 4 et le R de lEGF type II (ErbB2, neu) Signalisation 4 Implantation orthotopique Implantation ectopique proliférationinvasion

19 Inhibition directe des intégrines Activité des intégrines Molécules peptidomimétiques Expression des intégrines Interférence dARN Tucker, Curr Oncol Rep, 2006 Activité des intégrines Anticorps bloquants

20 Inhibition indirecte des intégrines Inhibition des voies de signalisation Inhibiteurs pharmacologiques dirigés contre la protéine cible Pseudo substrat Ligand compétitif ATP Substrat non hydrolysable Ex: PKC

21 Déterminer le type dintégrines exprimé par une cellule Expression totale –Western-Blot Expression à la surface externe des cellules –Cytomètrie de flux –Immunofluorescence –Biotinylation des protéines de surface, puis Immunoprécipitation puis Western Blot Test indirect –Test dadhésion en présence dinhibiteurs pharmacologiques des intégrines (anticorps bloquants, agents peptidomimétiques) Méthodologie pour étude des intégrines

22 Déterminer quelle est la voie de signalisation activée par une intégrine – Etude de lexpression/activité des protéines en aval des intégrines en utilisant des inhibiteurs pharmacologiques ou des ARNi dirigés contre les intégrines ou en activant les intégrines – Caractérisation des molécules de signalisation (co-précipitations, Western-Blot)

23 Méthodologie pour étude des intégrines Déterminer la fonction dune intégrine –Test dadhésion sur protéines matricielles DO Substrat 16 h 4°C Cellules 2-6 h 37°C Fixation Schéma expérimental : Coloration +/-Anticorps/Inhibiteurs des intégrines

24 Système Cre-Lox


Télécharger ppt "Etude du protocole du TP2 Généralités sur les intégrines Sylvie Monferran."

Présentations similaires


Annonces Google