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Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique www.imagesdepicardie.com.

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2 Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique

3 Génie métabolique Optimisation des procédés de fermentation industrielle basée sur la compréhension et la modulation de voies métaboliques Conditions de culture Génie génétique Définition valable pour seulement pour des aspects très restreints du génie métabolique chez les végétaux

4 « Champs de microbes » : utilisation industrielle de bactéries photosynthétiques par lentreprise Solazyme Protéines recombinantes Caroténoïdes Masanaru Misawa Production de métabolites secondaires par le biais de cultures de cellules ou de tissus végétaux en bioréacteurs Ex: Shikonine Génie métabolique végétal dans le cadre de cultures en « bioréacteurs »

5 Génie métabolique appliqué aux « plantes entières » Productivité Assimilation des éléments Tolérance aux stress Phytoremédiation Qualité Augmentation des teneurs Vitamines, Principes actifs médicamenteux, Pigments, Parfums, Arômes, Acides gras insaturés … Diminution des teneurs Glucosinolates, Acide érucique, Arômes indésirables, Tannins, Lignine Points abordés dans les cours

6 Génie métabolique appliqué à la production de composés à usage pharmaceutique et cosmétique

7 Principaux métabolites secondaires utilisés dans lindustrie pharmaceutique et cosmétique Alcaloïdes Alcaloïdes indoliques Etc.. Composés mixtes et glycosides Glycosides cardiotoniques Composés phénoliques Flavonoïdes, quinones … etc… Isoprénoïdes Tocopherol…etc..

8 Le problème de la production des métabolites II aires Synthèse organique Lorsquelle est possible… Culture de plantes au champ Lorsquon la maîtrise Culture in vitro Lorsque les molécules en valent la peine…

9 Synthèse organique : les plantes comme modèle Souvent possible, à bas prix Ex : aspirine Mais, ce nest pas toujours possible… Réaction de Kolbe

10 Culture de plantes aux champs Plantes médicinales ~7000 ha en France Culture peu coûteuse Mais, ce nest pas toujours possible…

11 Exemples de plantes médicinales difficiles à cultiver Lif Pervenche de Madagascar

12 Autres organismes biologiques Expression hétérologue de gènes de plantes chez dautres microorganismes hôtes ? Caractères fortement polygéniques Expression étroitement coordonnée de plusieurs dizaines de gènes dans la synthèse dun seul métabolite Génie métabolique appliqué aux végétaux

13 Cultures in vitro pour la production de métabolites secondaires Un dogme ancien et erroné : « les suspensions cellulaires ne produisent pas de métabolites secondaires » ( ) Une technologie récente ( ) et des résultats assez peu nombreux…

14 Les espoirs initiaux 1956 : Pfizer inc. Dépose un brevet concernant la production de métabolites par des cultures cellulaires de plantes Fin des années 60 : La visnagine et la diosgenine sont produites à plus fortes concentrations dans des cultures cellulaires que dans les plantes Ça « coince » avec les molécules les intéressantes : vinblastine, vincristine… Un succès : la Xn de shikonine commercialisée en 1983 par Mitsui Petrochemicals

15 Japon : la tête de proue Outils de fermentation industrielle Extension aux cultures végétales 70s (Japan Tobacco Inc) production de biomasse pour la confection de cigarettes (réacteurs de L) Meiji Seika, Nitto Denko Co : production de masse de Panax ginseng in vitro 1982 : 5ème congrès de lIAPTC (=IAPB) au japon : nombreuses avancées dans la production de métab II, dont la shikonine par Mitsui Petrochemicals

16 Lithospermum erythrorhizon (Borraginacées) Shikonine : 10% de la MS de la racine Cosmétique Phytothérapie

17 Cultures en bioréacteur de cellules de Lithospermum erythrozhizon

18 Trois succès durables Shikonine Berbérine Cultures cellulaires Saponines du ginseng Cultures de racines à grande échelle

19 Un alcaloïde isoquinolique : la berbérine Malaria Principal alcaloïde accumulé dans le rhizome de Coptis japonica (Renonculacée) Années 70 : selection dune souche hyperproductrice de berbérine, transférée à Mitsui Biochemicals Optimisation : culture à haute densité (optimisation de loxygénation et du milieu), 0.45 g /L / jour

20 Production de saponines par Panax ginseng Traitement des ulcères 5 ans de culture Destruction de la racine pour extraction Culture de racines en réacteur

21 Quelque systèmes de production à létude taxol Vinblastine, Vincristine Elly Lilly & Co Glycosides Concurrence avec la synthèse chimique

22 Paclitaxel (taxol) Écorce de Taxus brevifolia (If du pacifique) Propriétés pharmacologiques Antimitotique tubulo-affine Applications cancers à métastases Cancer de lovaire et du sein

23 Culture in vitro pour la synthèse de Taxol Taxol: traitement 1g /an 1g = 3 arbres (Taxus sp., lIf) de 150 ans Productivité in vitro : mg / L en deux semaines

24 Taxus baccata (Taxaceae) 10-désacétylbaccatine III dans les feuilles : récolte non-destructrice Précurseur dhémisynthèse Toxotère ® par Sanofi-Aventis

25 Catharanthus roseus (Apocynaceae) Le thé de pervanche utilisé en pharmacopée traditionnelle en Jamaïque comme antidiabétique Années 50 : Stimulation de la sécrétion dinsuline ?? Pas du tout mais diminution des globules blancs Traitement des leucémies

26 Vinblastine et vincristine Faible rendements … Vinblastine : 2-10 g ( k) / tonne de MS Vincristine : 0.5 g / tonne de MS Maladie de HodgkinLeucémies

27 Les alcaloïdes de la pervenche de Madagascar Au moins 70 alcaloïdes identifiés dont : Dans les feuilles Vincristine et vinblastine (anticancéreux) Dans les racines et les suspensions cellulaires Serpentine et Ajmalicine : (antihypertenseurs)

28 Production dajmalicine par C. roseus Hypothèses : 800 Kg / an 260 µg ajmalicine / g MS / jour Suspensions cellulaires : 3150 $/Kg Plantes entières : 619 $ / Kg Source : FAO (http://www.fao.org/docrep) Au contraire la culture de Lithospermum est longue (maturité 3-5 ans) et sensible au variations climatiques : les cultures cellulaires sont plus rentables

29 Lhémisynthèse 1974 Équipe de Potier (Paris) Dimérisation de deux alcaloïdes monomeriques : catharantine et vindoline vinorelbine (navelbine TM )

30 ß-methyl-digoxine (Digitalis) Cardiotoniques Mais de nouveaux cardiotoniques de synthèse sont apparus Les projets de production par CIV sont tombés à leau Les suspensions cellulaires sont tout de même utilisées pour réaliser les étapes finales :bioconversion

31 Bioconversion Premières étapes de synthèse chimique Finalisation des molécules par culture in vitro

32 Ajout de précurseurs dans le milieu de culture : bioconversion Amélioration ABC A C coût B / coût C ? B

33 Bioconversion 12-hydroxylation de la beta-methyl- digitoxine digoxine Digitalis lanata OH Reinhard et Alfermann 1982 Boehringer Mannheim Co : réacteurs de L

34 Bioconversion des extraits végétaux Bioconversion des extraits par fermentation lactique en réacteur teneurs en trois ginsenosides dinterêt : X 60 Pathologies causées par Helicobacter pilorii (ulcères) Brevet (2003) Ginseng Science

35 Méthodes de production in vitro Du prototype à la technologie industrielle

36 Mise au point en flacons de culture

37 Principes de base La plupart des métabolites secondaires sont intracellulaires, intravacuolaires Quantité produite = biomasse produite X concentration Production in vitro

38 Biomasse temps Nombre de cellules 3 semaines Alors : dX = dt X et ln X = (t-t 0 ) X0X0 X0X0 Croissance exponentielle t0t0 Production in vitro

39 Production de métabolites temps Quantité de cellules Quantité de métabolites secondaires Découplage croissance/synthèse de Métabolites Ii aires Production in vitro

40 Exemple : Production dajmalicine par Catharanthus en deux étapes: Linoculation de la phase de production avec des cellules en phase stationnaire avancée donne une productivité 4 fois supérieure Indicateur : inoculation avec des cellules qui ont consommé tout le nitrate dans leur milieu Schaltmann et al (1996) Biotech. Bioengineering

41 MG5 M9 Procédé de production de shikonine : batch en 2 étapes Tabata et al. Mitsui Corp. 200 L 9 j 750 L 14 j Filtration Air Shikonine Inoculum Croissance Production 4 g/L

42 Culture en bioréacteurs

43 Passage du flacon au réacteur Dans certains cas : diminution de la synthèse : Catharantus Composition de la phase gazeuse: Taxus: Baisse de O 2 augmentation taxol Augmentation CO 2 diminution taxol Mirjalili (1996) Biotechnol Bioengineering

44 Réacteurs forte capacité Contrôle des paramètres pH, O 2, nutriments, précurseurs, éliciteurs… Agitation, aération Qualité de lumière

45 Les freins du « scale up » Transferts de masse gaz-liquide (oxygène) Sensibilité au cisaillement ( 100 t/min) Homogénéisation du milieu : Sédimentation Attachement Contact cellules-liquide Production in vitro

46 Agitation mécanique Bullage Pales Tambour rotatif

47 Wave bioreactors

48 Culture dorganes Dans plusieurs cas, les cellules indifférenciées ne produisent pas la molécule désirée: cellules de Catharanthus : pas de vinblastine Cellules de pavot : pas de morphine Production de saponines par le Panax ginseng : culture de racines obligatoire

49 Culture dorganes Racines transformées (hairy roots) Croissance Production de molécules Stabilité génétique Cultures de tiges feuillées

50 Hairy roots de Psoralea lachnostachys Stratégies alternatives : hairy roots

51 La croissance Stratégies alternatives : hairy roots

52 « plantes à traire » INPL-ENSAIA, Nancy Cultures en hydroponie Solution nutritive en circuit fermé avec filtration des métabolites exsudés par les racines E. Gontier et F. Bourgaud Datura inoaxia : Hyoscyamine, scopolamine (neurosédatifs)

53 Perméabilisation de cellules Amélioration Faire sortir les produits intracellulaires Petite taille moléculaire des métabolites secondaires perméabilisation des membranes phospholipidiques

54 Optimisation de la synthèse Impact des conditions de culture sur la synthèse Elicitation

55 Comment augmenter la synthèse? Sélection de lignées fortement productrices Choix de la source carbonée et ajout de précurseurs simples Paramètres physiques et temporels de la culture Eliciteurs biotiques ou abiotiques Hormones

56 Elicitation par un facteur biotique de la synthèse de sanguinarine Un alcaloïde isoquinoléique synthétisé dans les suspensions cellulaires dopium

57 TYDC

58 Facchini et al (Plant Physiol.) Concentration cellulaire en sanguinarine (mg / g DW) Temps après élicitation (h) Elicitation des teneurs en sanguinarine par lextrait de Botrytis

59 Activité relative TYDC (%) Temps après élicitation (h) Elicitation de lactivité tyrosine décarboxylase par Botrytis Facchini et al (Plant Physiol.)

60 Lacide Jasmonique Un éliciteur « miracle »

61 Matsuno et al FEBS Lett. Elicitation de la synthèse dacide rosmarinique chez Lithospermum erythrorhizon Méthyl Jasmonate Control Yeast Extract

62 Matsuno et al FEBS Lett.

63 Utilisation industrielle de lacide jasmonique Elicitation des cellules de Taxus pour la synthèse de taxol Fin des années 90 : rendement multiplié par 100 en particulier grâce au méthyl- jasmonate La production industrielle in vitro devenait alors envisageable

64 Génie génétique et génie métabolique Stratégies moléculaires pour manipuler des voies de biosynthèse

65 Loutil moléculaire au service du génie métabolique Caractérisation des voies de biosynthèse Caractérisation des principales étapes enzymatiques Clonage des gènes correspondants Transgénèse Surexpression de gènes homologues De gènes hétérologues (plantes, bactéries…) RNAi

66 Transgenèse de lignées cellulaires ou de plantes entières Système plante entière insatisfaisant Système in vitro insatisfaisant Souches cellulaires transformées Plantes entières transformées

67 Capell et Christou (2004) Curr. Opin. Biotech. Stratégie « Étape enzymatique »

68 Modulation de la voie synthèse de la scopolamine chez Hyoscyamus Häkkinen et al.

69 Surexpression de la hyoscyamine 6- hydroxylase (H6H) et de la putrescine methyl-esterase (PMT) Témoin racines transformées par A. rhizogenes H6H PMT PMT + H6H Témoin Zhang et al.

70 Stratégie « Facteurs de transcription» Moduler lexpression de gènes codant les enzymes impliquée dans toute une chaîne de biosynthèse

71 Stratégie « Facteurs de Transcription »

72 Catharanthus Promoteurs régulés par le facteur de transcription ORCA3 Gantet et Memlik 2002 Trends in Pharm Sci

73 CONCLUSIONS Production de métabolites 2 aires Quelques réussites en CIV De gros efforts de recherche depuis 40 ans Lespoir renouvelé par le génie génétique CIV Plantes entières

74 Lecture conseillée pour approfondir les aspects « bioréacteur » PLANT TISSUE CULTURE: AN ALTERNATIVE FOR PRODUCTION OF USEFUL METABOLITE

75 Génie métabolique et horticulture Manipulation de la voie de biosynthèse des anthocyanes Moonshadow (Florigene)

76 CHS F3HF35H DFR

77 Expression de la DFR de maïs chez le Pétunia 1987 (Nature) Premier succès : obtention de pétunias oranges contenant de la pelargonidine Expression hétérologue dune DFR (dihydroflavonol réductase) de maïs

78 F3H F35H DFR de maïsDFR de pétunia naringenine

79 Comment obtenir une rose bleue ? (Pari lancé en 1840…) Les roses sont déficientes en F35-hydroxylases : pas danthocyanes dérivées de la delphinidine

80 Surexpression de la F35H Katsumoto et al. Plant and Cell Physiology (11):

81 Pour améliorer la qualité du bleu…. Silencing de la DFR de rose Surexpression de la DFR dIris Surexpression de la F35H de violette F3H F35H

82 Katsumoto et al. Plant and Cell Physiology (11):

83 Génie métabolique et plantes aromatiques

84 Biosynthèse du menthol Amélioration quantitative et qualitative de lhuile essentielle de menthe par génie métabolique menthol OH

85 Trichomes glandulaires chez la menthe plants/oils/www.microscopix.co.uk/ plants/oils/. Turner et Croteau (2004) Plant Phy.

86 Le menthol : un monoterpène Mahmoud et Croteau (2001) PNAS IPP

87 Deux approches Quantitative Modulation des activités enzymatiques en amont de la voie de biosynthèse Qualitative Modulation des activités enzymatiques en aval de la voie de biosynthèse

88 2 x acétyl CoA Mévalonate Mévalonate 5- diphosphate DXPS DXR MCT CMK MECPS 2-C-Méthyl-D- erythritol-2,4- cyclodiphosphate Isopentényl diphosphate Diméthylallyl diphosphate IPPI MDC Pyruvate + G3P Terpenoïdes Cytosol Plaste Goulot détranglement ?

89 Surexpression de la 1-deoxyxylulose-5- phosphate reductoisomerase (DXR) chez la menthe poivrée Augmentation de rendement sans changement de composition LignéeRendement huile (mg/g MF) Sauvage1.8 DXR62.6 DXR72.3 DXR82.4 Mahmoud et Croteau (2001) PNAS

90 Biosynthèse du menthol Mahmoud et Croteau (2001) PNAS Cytochromes P450 (Réticulum) LeucoplastesMitochondrie

91 Antisens sur la menthofurane synthase lignéeOil yeald (mg/g FW) LimoneneMenthoneMenthofuranePulégoneMenthol sauvage MFS-as Changement de composition sans changement de rendement Mahmoud et Croteau (2001) PNAS

92 Génie métabolique appliqué à la foresterie

93 Modification du contenu en lignine par transgenèse

94 Principaux constituants du bois Lignine (25%) (exemple de polymérisation de quelques unités G) Cellulose (50%) Hémicellulose (25%)

95 Problématique Fabrication de papier Ecorçage/Mise en copeaux Délignification au sulfate alcalin=procédé kraft Délignification au bisulfite (acide) Blanchiment : Chlore, Peroxyde Coût énergétique Impact environnemental La lignine : un facteur majeur de difficulté dans le procédé de fabrication Circuit fermé Effluents

96 Hu et al Nature Biotechnology

97 Augmenter le ratio cellulose/lignine par génie génétique Stratégie n°1 : amélioration quantitative

98

99 Répression par stratégie antisens

100 Réprimer la 4CL, mais laquelle ? Chez le peuplier : deux isoformes Quelles sont leurs spécificités de substrat? Dans quels tissus sont-elles exprimées? Les deux isoformes contribuent- elles à la synthèse de lignines ?

101 Hu et al PNAS

102 Pt4CL2 Pt4CL1 Spécificités de substrat des deux isoformes de la 4-coumarate:CoA ligase

103 Localisation histologique de lexpression de Pt4CL1 et Pt4CL2 Épiderme Xylème Northern BlotActivité GUS Feuilles Tiges 4CL2 4CL1 Hu et al PNAS

104 Conclusions La 4CL1 est impliquée dans la synthèse des monomères de la lignine La 4CL2 est impliquée dans la synthèse dautres composés phénoliques (métabolites secondaires) Pour altérer la synthèse des monomères de la lignine, une stratégie « antisens » doit être ciblée sur la 4CL1

105 Contrôle du phénotype : quantité de lignines Hu et al Nature Biotechnology Témoin Lignées transgéniques % Lignin reduction Témoin Transgénique

106 Phénotype : ratio cellulose / lignine Hu et al Nature Biotechnology

107 Implications Vitesse de croissance accrue Avantage technologique Questionnement sur les flux de gènes ? Effets secondaires possibles de la diminution des niveaux de lignine Attaques pathogènes Décomposition du bois dans la litière rôle de puit de carbone pour les arbres

108 Modifier la composition de la lignine par génie génétique Stratégie n°2 : amélioration qualitative

109 Bois dur ou bois tendre ? Lignine GLignine S/G

110 Hu et al Nature Biotechnology

111 La lignine : un polymère dunités phénylpropanoïdes Liaison moins résistante : procédé de fabrication du papier plus facile Lorsque la position 5 est disponible pour la polymérisation : lignine plus résistante

112 Approche retenue: expression de la F5H sous le contrôle dun promoteur de la C4H spécifique des tissus du xylème

113 % de lignine S dans les transformants Huntley et al (2003) J. Agric. Food Chem.

114 Efficacité de la mise en pâte chimicothermomécanique

115 Conclusions Le génie métabolique appliqué à lamélioration des espèces ligneuses horticoles, aromatiques ou médicinales est une approche crédible Cette approche ouvre un champ large dapplications Plusieurs applications sont déjà au stade de la commercialisation


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