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Transcriptome et immunologie Philippe Kastner. Transcriptome Ensemble des ARN messagers exprimées par un système biologique donné Le transcriptome est.

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Présentation au sujet: "Transcriptome et immunologie Philippe Kastner. Transcriptome Ensemble des ARN messagers exprimées par un système biologique donné Le transcriptome est."— Transcription de la présentation:

1 Transcriptome et immunologie Philippe Kastner

2 Transcriptome Ensemble des ARN messagers exprimées par un système biologique donné Le transcriptome est une mesure de létat biologique du système Méthode danalyse: puces à ADN (microarray)

3 ADN accroché à un support = ADN CIBLE Gène 1Gène 2 * * * * * Gène 1 Hybridation avec les ARN des cellules à étudier = SONDE FLUORESCENTE Dans les cellules étudiées : ARN 1 (produit par le Gène 1) présent ARN 2 (produit par le Gène 2) absent Méthode danalyse de lexpression des gènes basée sur le principe de lhybridation moléculaire Hybridation entre 2 molécules dADN complémentaires Double hélice ADN dénaturé Le principe des puces à ADN : lhybridation moléculaire

4 Quest-ce quun microarray ou une puce à ADN (DNA chip) ? Cest un matériau (généralement du verre, du plastique, autre) sur lequel on a fixé un très grand nombre dacides nucléiques différents de manière covalente = ADN CIBLE Les différents acides nucléiques (= ADN CIBLE ) sont bien ordonnés sur le support (on sait précisément où se trouve chaque gène) > « microarray » = microréseau LARN ou lADN extrait des cellules ou tissus à analyser est rendu fluorescent ( = SONDE FLUORESCENTE ) et est hybridé sur cette cible Les hybrides formés par complémentarité des bases (ADN CIBLE / SONDE FLUORESCENTE) sont repérés par mesure de la fluorescence Plus la fluorescence est intense, plus un ARN est abondant ANALYSES QUANTITATIVES

5 Deux grand types de puces à ADN AffymetrixPuces sur lame Photolithographie Affymetrix Dépôt avec un robot ou synthèse directe Fait maison ou achetable Mode de Fabrication Qui les fabrique ?

6 Les puces à ADN Affymetrix

7 GeneChip ® Probe Array

8 GeneChip ® Probe Arrays 11µm Each probe cell or feature contains millions of copies of a specific oligonucleotide probe Image of Hybridized Probe Array Over 1 million different probes complementary to genetic information of interest Single stranded, fluorescently labeled DNA target Oligonucleotide probe * * * * * 1.28cm GeneChip Probe Array Hybridized Probe Cell chips/wafer

9 Probe Tiling Strategy Gene Expression (25-mer)

10 Affymetrix Experimental System Fragment heat, Mg 2+ Washing & Staining Scanning Hybridization Biotin-labeled cRNA transcript Total RNA In vitro transcription (Biotin-UTP, Biotin-CTP) Biotin - labeled cRNA fragments Cells,tissues B B BB B B B B B B B B AAAA5 TTTT-T7 Reverse Transcription (oligodT linked to the sequence of the promoter of the RNA polymerase T7) AAAA-T7 TTTT-T7 Synthesis of the second strand of cDNA Streptavidin-Phycoerythrin 1 puce 1 image

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13 Mesures obtenues par puces affy Average difference Σ (PM-MM) / N Absolute call (Present/Absent) Défini par le nombre de paires PM/MM ou PM>MM Autres méthodes de calcul des valeurs dexpression possibles

14 Les puces sur lame

15 2 types de puces -Dépôt de micro-gouttes avec un robot - densité jusquà sptots par lame - artisanale (variabilité) - Synthèse directe - densité jusquà 106 spots par lame - Puces commerciales (Agilent, Nimblegen, Applied)

16 Puce artisanale spottéePuce commerciale Agilent

17 5 Reverse Transcription : oligodT + dUTP-Cy3 TTTTTTTT AAAAAAAA RNA degradation AAAAAAAA mRNA TTTTTTTT ss cDNA Cells A Reverse Transcription : oligodT + dUTP-Cy5 RNA degradation AAAAAAAA mRNA TTTTTTTT ss cDNA TTTTTTTT AAAAAAAA Cells B Direct labeling Hybridization Scanning microarray Cy3+Cy5 probe Scanarray 4000 (Perkin Elmer) Cy3 and Cy5 images overlayed Fluorescent labelling, Hybridization and Scanning

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19 Comment concevoir une expérience de microarrays ? But: déterminer les variations biologiques entre différents échantillons. Mais il faut distinguer celles-ci des variations liées à la technologie, ou à celles liées à la variabililé intrinsèque des échantillons

20 Thomas Hudson, Montreal Genome Center

21 Intensité croissante

22 6 échantillons: A1, A2, A3, B1, B2, B3 Microarray comprenant gènes échelle dexpression: Mesures pour un gène X A1A2A3B1B2B Test t: p = 0,01 Pour combien de gènes une telle valeur peut-elle être obtenue par hasard ? (« false discovery rate », ou FDR) Différences dexpression réelles ou artéfactuelle ?

23 ComparaisonNombre de gènes différentiels (Changement > 2x, p <0,01) (A1, A2, A3) vs (B1, B2, B3)300 (A1, B2, A3) vs (B1, A2, B3)150 (A1, B2, B3) vs (B1, A2, A3)200 (A1, A2, B1) vs (B2, B3, A3)100 Estimation du nombre de gènes différentiels « réels » La moitié des gènes différentiels est artéfactuelle ! Solutions: multiplier les réplicats augmenter la stringence des critères de sélection.

24 Number of replicatesType of sample Cell lines Mouse cells Mouse organs Human cells Human tumors Interested byBig changes >30 Small changes >60 variabilité Combien de réplicats sont-ils nécessaires pour une expérience réussie ?

25 Deux grands types de méthodes de « clustering » A.Méthodes hiérarchique: génération dun dendogramme (arbre) qui relie tous les gènes ou échantillons entre eux. B. Méthodes par partitionnement, qui divise les gènes en K classes ayant des profils similaires (K défini par lutilisateur) - K-means - Self-organizing maps (SOM) - analyse par composantes principales (PCA)

26 Regroupement en fonction de profils dexpression similaires 1. Gènes Évolution temporelle de lexpression des gènes dans des fibroblastes humains stimulés par du sérum (Pat Brown, 1997) Visualisation dune chorégraphie de lexpression génique dans le temps. 700 gènes

27 Different cell lines to be compared Genes belonging to one cluster Fold Changes Regroupement en fonction de profils dexpression similaires 2. échantillons

28 –N expériences – chaque gène est considéré comme un vecteur dans un espace de dimension N (coordonnées = valeurs dexpression dans chaque expérience) – Partitionnement des gènes en K classes optimisées selon des critères de proximité des gènes dans lespace vectoriel Méthodes par partitionnement (K-means, Fuzzy C-means, Self organizing maps)

29 Analyse par partitionnement de données correspondant à 5 types de leucémies T (20 groupes)

30 Ikaros TelJak2 Tal-Lmo1 bcat Analyse par partitionnement de données correspondant à 5 types de leucémies T (20 groupes)

31 B-catenin ICN1 Ikaros TelJak2 Tal-Lmo1 Visualisation des clusters FCM (4208 genes)

32 Applications des microarrays 1. Expression différentielle Question: pourquoi B est-il différent de A ? (KO vs WT; effet dun traitement; sain vs malade, etc …) Comparaison de A et B200 gènes différentiels !! Et ensuite ??? ….

33 Exemple d'application 1: Fonction du facteur de transcription AIRE dans les cellules épithéliales du thymus (Science 298, , 2002)

34 Problème: comment les lymphocytes T potentiellement autoréactifs contre des antigènes tissu-spécifiques sont-ils éliminés dans le thymus ? (tolérance centrale) Cellules épithéliales médullaires: expression "ectopique" de nombreux transcrits tissu-spécifique. Rôle dans la délétion clonale des lymphocytes T autoréactifs ? Aire: facteur de transcription muté dans le syndrome autoimmun poly-endocrine de type I. Autoimmunité contre de nombreux tissus

35 1. Fabrication d'un modèle de souris déficient pour Aire autoanticorps contre de nombreux tissus périphériques (rétine, glande salivaire, thyroide, etc..) 2. L'expression de Aire est restreinte au cellules épithéliales du thymus 3. Comparaison du transcriptome des cellules épithéliales thymiques de souris normales et mutantes

36 Comparaison du transcriptome des cellules épithéliales thymiques contrôle et déficientes pour AIRE diminution de l'expression de la plupart des gènes différentiels comparaison globale

37 La plupart des gènes différentiels sont des gènes spécifiques d'un tissu

38 Exemple 2: Lymphomes thymiques chez des souris mutantes pour le gène Ikaros Recherche de la voie moléculaire impliquée dans le développement de ces tumeurs par une analyse du transcriptome.

39 6 Ik L/L tumors 4 Tel-Jak2 tumors 5 non tumoral thymocytes Genes specifically deregulated in Ik L/L tumors ? Conception expérimentale

40 Hes1 Notch1 Deltex 1 pT Notch upregulation is associated with tumors lacking Ikaros Ik L/L tumors Ik L/L tumor TelJak2 tumors Notch pathway signature

41 Applications des microarrays 2. Transcriptome comme mesure phénotypique dun système biologique Concept: Profil apparenté de lexpression des gènes implique une similitude détat biologique Application principale: classification des tumeurs

42 Signature transcriptomique Ensemble de gènes caractéristiques dun état biologique donné -Type cellulaire (ex: signature des pDCs) - stimulation dune voie moléculaire

43 Exemple 3: analyse de la signature de cellules dendritiques plasmacytoïdes Liu et al, Nature Immunol, 2004

44 TLR7 (RNA) TLR9 (DNA) Virus sensors pDC IFN Plasma cell differentiation Th1 polarisation NK cell cytotoxicity CD8+ T cell cytotoxicity Other roles: - Tolerogenic function (induce T-reg activity) - secretion of other signaling molecules (IL12, chemokines) Plasmacytoid DCs: innate viral sensors stimulating adative immune responses Differentiation into APC

45 Comment les pDCs se développent-elles ? Des lignages de pDC séparés myéloïdes et lymphoîdes ? - Des pDCs peuvent être produites à parftir de précurseurs « myéloïdes » ou « lymphoïdes » - Les pDcs expriment certains gènes lymphoïdes (pTa, lambda5, Rag, SpiB) Les pDCs sont-elles apparentées aux DC conventionnelles ? Non: identification dun progéniteur commun monocytes/cDC qui ne possède pas de potentiel pDC Oui: Les souris dénuées du régulateur IRF8 sont dépourvues de pDCs et de cDCs Quels signaux/facteurs sont requis pour la différenciation des pDC ?

46 Une vue génomique des cellules dendritiques 1.Assemblage de profils dexpression génique pour la plupart des types cellulaires immunitaires (macrophages, neutrophiles, lymphocytes B, T, NK, pDCs, cDCs) 2. Pour lhomme et la souris 3.Clustering pour visualiser les distances entre lignage 4.Identification de programmes dexpression géniques conservés Robbins et al, 2008

47 Hierarchical clustering Principal component analysis (PCA) (Projection on first 2 dimensions) 1. SOURIS Similitude des profils transcriptomiques des DC

48 2. HOMME Publicly available datasets on Affymetrix U133 v2 Similitude des profils transcriptomiques des DC

49 Pan-DC genes pDC specific genes (500 genes) Conventional DC genes Signature des DC de souris (Fuzzy C-means clustering)

50 Signatures des DC humaines pDC genes Pan DC genes Conventional DC genes

51 B cellsT cellspDCscDCs Ebf1Camk4Epha2Arhgap22 Cd N04RikPacsin1Btbd4 Klhl14Trat1Zfp521Slamf8 Bank1CxCr6Sh3bgr l03Rik Pax5Tnfrsf25Tex2Nav1 Blr1Ccdc64Runx2Ct2a Ralgps2Plcg1Atp13a2Avpi1 CD79bLatMaged1Spint1 Gènes les plus fortement associés à des types de cellules spécifiques Rouge: connu pour être spécifique de ces lignages

52 Conclusion des études transcriptomiques Proximité des programmes géniques des pDC et cDC Programme conservés entre lhomme et la souris Les gènes spécifiques des DCs sont largement inconnus

53 Nature Immunology, October 7th, 2007

54 Homologies entre les sous-types de cellules dendritiques chez lhomme et la souris

55 Autres applications du compendium Classification de nouvelles populations cellulaires

56 Les cellules IkDC sont-elles des cellules dendritiques ? Interferon-producing killer dendritic cells (IkDC): - Capables de produire de lIFNa/b - expriment certains marqueurs des DCs - propriétés cytotoxiques suggéré comme étant un sous-type de pDC Les IkDC sont un sous-type de cellules NK, et ne sont pas apparentées aux DC!

57 human mouse Les DCs dérivées des monocytes in vitro sont distinctes des DCs résidentes

58 Exemple 4: Absence de cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) chez les mutants IkL/L

59 Les pDC sont-elles bloquées dans leur différenciation dans la moelle osseuse ? Présence dune population exprimant un marqueur des pDC, 120G8, mais pas B220

60 Analyse du transcriptome (Affymetrix: gènes) Comparaison à divers types cellulaires hématopoïétiques La population 120G8+ mutante appartient-elle au lignage des pDC ?

61 Les pDC IkL/L possèdent la signature pDC Dérégulation (surexpression) dun grand nombre de gènes Sous-signature commune avec les DC conventionnelles

62 Surexpression de la plupart des gènes dérégulés

63 Applications des microarrays 3. Data mining Recherche dinformations « cachées » dans les données de transcriptome Confrontation des données: - à dautres sets de données transcriptomiques - aux données de séquence et dorganisation des génomes - aux données de fonctions des gènes

64 J. Exp. Med. 197, (2003) Exemple 4: signatures transcriptomiques dans le lupus (maladie auto-immune)

65 Signatures « interféron » et « granulopoièse » chez les patients atteints de lupus

66 Rôle de linterféron dans la pathologie du lupus Différenciation anormale des granulocytes dans le sang des patients lupiques Analyse transcriptomiquehypothèses

67 -Etude des réponses immunitaires de lhôte après infection par des souches dinfluenza de pathogénicité différente chez la souris -Analyse du transcriptome des cellules du poumon après 1, 3 et 5 jours dinfection. Exemple 5 (Nature 2006)

68 Souche de la pandémie 1918: réaction beaucoup plus importante de lhôte, conduisant à la destruction de tissu

69 Conclusion Transcriptome: outil puissant pour: 1. Obtenir une vision densemble dun système biologique (classification des échantillons) 2. Effectuer une analyse sans à priori (identification de voies moléculaires et gènes potentiellement importants) hypothèses


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