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Direction des Sciences du Vivant Institut de Biologie et de Technologies de Saclay Service de Bioénergétique, Biologie Structurale et Mécanismes CEA Saclay.

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1 Direction des Sciences du Vivant Institut de Biologie et de Technologies de Saclay Service de Bioénergétique, Biologie Structurale et Mécanismes CEA Saclay URA 2096 Protéines Membranaires Transductrices dEnergie

2 ATP synthase année

3 Localisation et fonction des ATP synthases Structure générale des ATP synthases et aperçu du mécanisme Les hypothèses fondatrices sur le mécanisme Lhypothèse du proton substrat Le mécanisme de changement daffinité Structure détaillée de la partie F 1 Les sites nucléotidiques Laxe central Structure de la partie F 0 Architecture du complexe F 0 F 1 Structure de la sous-unité c Structure de la sous-unité a Structure de la sous-unité b Mécanisme de la partie F 1 Evidence biochimique de la rotation Visualisation de la rotation Etats catalytiques, occupation des sites et étapes du mouvement rotatif Mécanisme de la partie F 0 Couplage entre F 0 et F 1 Stoechiométrie H + /ATP nombre de sous-unités c Elasticité et problèmes connexes Régulation de lactivité des ATP synthases Le cas des chloroplastes Le cas de E.coli Existe-t-il des cliquets moléculaires? Comparaison E.coli -chloroplaste Le cas des mitochondries Le peptide inhibiteur IF1 Les V-ATPases Structure générale des V-ATPases Les sous-unités c des V-ATPases Fonctions des V-ATPases Stoechiométrie H + /ATP: une affaire de pignon Les hélicases hexamériques

4 H2OH2O PS2 complexe I cyt b 6 f cyt bc PC cyt c PS1 cyt oxydase ATP synthase NADH NADP + O 2 Q pool H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ ADP + P i ATP + H 2 0 e-e- e-e- e-e- e-e- e-e- e-e- e-e- e-e- e-e- STROMA MATRICE LUMEN ESPACE INTERMEMBRANAIRE

5 Localisation et fonction des ATP synthases Structure générale des ATP synthases et aperçu du mécanisme Les hypothèses fondatrices sur le mécanisme Lhypothèse du proton substrat Le mécanisme de changement daffinité Structure détaillée de la partie F 1 Les sites nucléotidiques Laxe central Structure de la partie F 0 Architecture du complexe F 0 F 1 Structure de la sous-unité c Structure de la sous-unité a Structure de la sous-unité b Mécanisme de la partie F 1 Evidence biochimique de la rotation Visualisation de la rotation Etats catalytiques, occupation des sites et étapes du mouvement rotatif Mécanisme de la partie F 0 Couplage entre F 0 et F 1 Stoechiométrie H + /ATP nombre de sous-unités c Elasticité et problèmes connexes Régulation de lactivité des ATP synthases Le cas des chloroplastes Le cas de E.coli Existe-t-il des cliquets moléculaires? Comparaison E.coli -chloroplaste Le cas des mitochondries Le peptide inhibiteur IF1 Les V-ATPases Structure générale des V-ATPases Les sous-unités c des V-ATPases Fonctions des V-ATPases Stoechiométrie H + /ATP: une affaire de pignon Les hélicases hexamériques

6 3 (E.coli, chloroplaste) (mitochondrie) (E.coli, chloroplaste) b 2 (E.coli) b+b (chloroplaste) b (mitochondrie) a c H+H+ H+H+ F1F1 F0F0 (Mg)ADP + P (Mg)ATP + H 2 O OSCP (mitochondrie) membrane

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8 Localisation et fonction des ATP synthases Structure générale des ATP synthases et aperçu du mécanisme Les hypothèses fondatrices sur le mécanisme Lhypothèse du proton substrat Le mécanisme de changement daffinité Structure détaillée de la partie F 1 Les sites nucléotidiques Laxe central Structure de la partie F 0 Architecture du complexe F 0 F 1 Structure de la sous-unité c Structure de la sous-unité a Structure de la sous-unité b Mécanisme de la partie F 1 Evidence biochimique de la rotation Visualisation de la rotation Etats catalytiques, occupation des sites et étapes du mouvement rotatif Mécanisme de la partie F 0 Couplage entre F 0 et F 1 Stoechiométrie H + /ATP nombre de sous-unités c Elasticité et problèmes connexes Régulation de lactivité des ATP synthases Le cas des chloroplastes Le cas de E.coli Existe-t-il des cliquets moléculaires? Comparaison E.coli -chloroplaste Le cas des mitochondries Le peptide inhibiteur IF1 Les V-ATPases Structure générale des V-ATPases Les sous-unités c des V-ATPases Fonctions des V-ATPases Stoechiométrie H + /ATP: une affaire de pignon Les hélicases hexamériques

9 H+H+ H+H+ pH e =6 pH i =6 K+K+ K+K+ a) incubation acide H+H+ H+H+ pH e =8 pH i =6 K+K+ K+K+ ADP + P i ATP H+H+ b) transfert à pH élevé synthèse d'ATP pH e =8 pH i =8 c) nouvel équilibre Les expériences historiques de Jagendorf ont montré quune force protomotrice complètement artificielle pouvait induire la synthèse de lATP [Jagendorf A.T. et Uribe E., Proc. Natl Acad. Sci. USA (1966) 55, ]

10 Hypothèse (abandonnée) du «proton substrat» (daprès P. Mitchell) [Mitchell P., FEBS Lett. (1974) 43, ] O O O - P O P Ad O Mg O O P + OH 3 H + H 2 O O O O - P O P Ad O Mg O O P + OH O O O - P O P Ad O Mg O O - P OH O - 2 H + MgATP 2- Les ATP synthases peuvent être fragmentées en un « canal à protons » F 0 et une ATPase soluble F 1 F0F0 H+H+ F1F1 ATP+H 2 O ADP + P i

11 énergie H2OH2O Coopérativité (modèle à 2 sites) ATP P i ADP Hypothèse du changement daffinité ( P. Boyer) [Boyer P.D., Cross R.L. et Momsen W. PNAS (1973) 70, ] H + O - O - O O H P H H O b) oxygènes échangeables du phosphate [Daprès Gresser M.J., Myers J.A. et Boyer, P.D. (1982) J. Biol. Chem. 257, ] ATP

12 EF 0 F 1 9 nm 11 nm 4.5 nm MF 1 2 nm Daprès Boekema E.J., Berden J.A. et Heel M. G., Biochim. Biophys. Acta (1986) 851, Daprès Gogol E.P., Lucken U. et Capaldi R.A., FEBS Lett. (1987) 219, Daprès Wilkens S. et Capaldi R.A., Nature (1998) 393, 29

13 NUCLEOTIDES ET ANALOGUES Analogues photoactivables -O-O 3 -arylazido-ATP O O O HH H OH CO CH 2 NH N3N3 N N CH C C N C N NH 2 H CH 2 OP O O-O- OP O O-O- P O O-O- NO 2 N C NH 2 O O OH HH H N N CH C C H CH 2 OP O O-O- OP O O-O- -O-OP O O-O- C N N3N3 2-azido-ATP N C NH 2 O O OH HH H N N C C C H CH 2 OP O O-O- OP O O-O- -O-OP O O-O- CH N N3N3 8-azido-ATP CH -O-OO O OH HH H N N CH C C N C N NH 2 H CH 2 OP O O-O- NH P O O-O- P O O-O- analogue non hydrolysable AMP-PNP -O-OO O OH HH H N N CH C C N C N NH 2 H CH 2 OP O O-O- OP O O-O- P O O-O- NH 2 C analogue hydrolysable GTP

14 Localisation et fonction des ATP synthases Structure générale des ATP synthases et aperçu du mécanisme Les hypothèses fondatrices sur le mécanisme Lhypothèse du proton substrat Le mécanisme de changement daffinité Structure détaillée de la partie F 1 Les sites nucléotidiques Laxe central Structure de la partie F 0 Architecture du complexe F 0 F 1 Structure de la sous-unité c Structure de la sous-unité a Structure de la sous-unité b Mécanisme de la partie F 1 Evidence biochimique de la rotation Visualisation de la rotation Etats catalytiques, occupation des sites et étapes du mouvement rotatif Mécanisme de la partie F 0 Couplage entre F 0 et F 1 Stoechiométrie H + /ATP nombre de sous-unités c Elasticité et problèmes connexes Régulation de lactivité des ATP synthases Le cas des chloroplastes Le cas de E.coli Existe-t-il des cliquets moléculaires? Comparaison E.coli -chloroplaste Le cas des mitochondries Le peptide inhibiteur IF1 Les V-ATPases Structure générale des V-ATPases Les sous-unités c des V-ATPases Fonctions des V-ATPases Stoechiométrie H + /ATP: une affaire de pignon Les hélicases hexamériques

15 MARQUAGE DES RESIDUS CATALYTIQUES DE PAR 2-azido-ANP origine du F 1 résidu modifié Peptide marqué Mitochondrie boeuf Chloroplaste épinard Escherichia coli Tyr-345 Tyr-362 Tyr-331 A I A E L G I Y* P A V D P L D S T S R G I Y* P A V D P L D S T S T M L Q P R Q I A S L G I Y* P A V D P L D S T S R I M P N I V G S E H Y* D V A R I V G E E H Y* E I A Q R Q L D P L V V G Q E H Y* D T A R MARQUAGE DES RESIDUS NON CATALYTIQUES DE PAR 2-azido-ANP origine du F 1 résidu modifié Peptide marqué Mitochondrie boeuf Chloroplaste épinard Escherichia coli Tyr-368 Tyr-385 Tyr-354 Daprès Wise J.G., Hicke B.J. et Boyer P.D., FEBS Lett. (1987) 223, R272 -Y368 F357 Mg P363 R362 Q432 S177 Q172 D269 D270 E328 K273 Q208 Y203 P-loop (QTGKTS) SITE NON CATALYTIQUE (par défaut, les résidus sont situés sur ) F424 A121 F418 Y345 T425 E192 V164 R189 -R373 E188 -S344 G159 D256 P-loop (GVGLTV) Mg SITE CATALYTIQUE (par défaut, les résidus sont situés sur ) D après Abrahams J.P., Leslie A.G., Lutter R. et Walker J.E., Nature (1994) 370,

16 E DP 20 Å DP TP E DP TP E DP TP DP TP E DP TP E TP E DP TP E DP TP E DP TP E DP TP E Interfaces catalytiques Interfaces non catalytiques Daprès Abrahams J.P., Leslie A.G., Lutter R. et Walker J.E., Nature (1994) 370,

17 TP E Le pontage de sous-unités proches permet de savoir si elles bougent lune par rapport à lautre durant le cycle catalytique. Double mutation en cystéine Pontage INACTIVATION Quand la topologie nest pas connue avec certitude, il permet aussi détablir des proximités (étude du secteur membranaire F 0 ). (Aggeler R., Haughton M. A. & Capaldi R. A.(1995) J. Biol Chem. 270, )

18 Structure de la partie centrale du sous-complexe F 1 dans le complexe F 1 entier (mito) de mitochondrie dans le complexe entier é La sous-unité (bactérie, chloroplaste) ou (mitochondrie) est formée essentiellement dun tonneau et de 2 hélices. La sous-unité bactérienne isolée, solubilisée (RMN) ou cristallisée (RX) a la même configuration que son homologue dans lATPase mitochondriale, cest-à- dire que les deux hélices forment une épingle à cheveux. En revanche, dans le complexe de E.coli cristallisé, la boucle entre les deux hélices souvre largement et la deuxième hélice est plaquée contre la sous-unité. complexe de E.coli de E. coli en solution ou cristallisé Daprès Gibbons C., Montgomery M.G., Leslie A.G. et Walker J.E., Nat. Struct Biol. (2000)7, Rodgers A.J. et Wilce M. C., Nat. Struct. Biol. (2000) 7, Uhlin U., Cox G.B. and Guss J.M., Structure (1997) 5,

19 Désénergisé Energisé µ H + ~ S S SH S +DTT +maléimide SH 89 SH 322 SH +monomaléimide+dimaléimide SSSH bloqué découplé 6 Å

20 Localisation et fonction des ATP synthases Structure générale des ATP synthases et aperçu du mécanisme Les hypothèses fondatrices sur le mécanisme Lhypothèse du proton substrat Le mécanisme de changement daffinité Structure détaillée de la partie F 1 Les sites nucléotidiques Laxe central Structure de la partie F 0 Architecture du complexe F 0 F 1 Structure de la sous-unité c Structure de la sous-unité a Structure de la sous-unité b Mécanisme de la partie F 1 Evidence biochimique de la rotation Visualisation de la rotation Etats catalytiques, occupation des sites et étapes du mouvement rotatif Mécanisme de la partie F 0 Couplage entre F 0 et F 1 Stoechiométrie H + /ATP nombre de sous-unités c Elasticité et problèmes connexes Régulation de lactivité des ATP synthases Le cas des chloroplastes Le cas de E.coli Existe-t-il des cliquets moléculaires? Comparaison E.coli -chloroplaste Le cas des mitochondries Le peptide inhibiteur IF1 Les V-ATPases Structure générale des V-ATPases Les sous-unités c des V-ATPases Fonctions des V-ATPases Stoechiométrie H + /ATP: une affaire de pignon Les hélicases hexamériques

21 Asp61 oligomère sous-unités c RECONSTRUCTION PARTIELLE DU COMPLEXE F 0 F 1 MITOCHONDRIAL [daprès Stock D., Leslie A.G. et Walker J.E., Science (1999) 286, ] et Dickson, K., Silvester, J. A., Fearnley, I. A., Leslie, A.G.W. et Walker, J.E. (2006) EMBO J. 25, ] b d F6 OSCP

22 [daprès Girvin M.E., Rastogi V.K., Abildgaard F., Markley J.L. et Fillingame R.H., Biochemistry (1998) 37, ] Asp61 Structure (RMN) de la sous-unité c de E.coli

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24 sous-unité a, hélice 4 sous-unité c, hélice 2 A D I L N M I G L I Y L I structure vraisemblable de la sous-unite a [daprès Long J.C, DeLeon-Rangel, J. et Vik S.B., J. Biol. Chem. (2002) 277, ; Zhang, D.et Vik, S.B., J. Biol. Chem. (2003) 278, ] pontages XnC entre a et c [daprès Jiang W. et Fillingame R.H., Proc. Natl Acad. Sci. USA (1998) 95, ] L F L I A P L A L T I F V W V F L M N L M D L L P I D L L P A V S R F L V L L V F G L V S F M S D I N I T W F T F P A P P N Q D V L S T R L D G L Q L N N L H H I Y D Q P T M N E S A M V I G F V N K L K A T S G V P G K F Q T A I E G V K D S Y M H G K S K 123 S E E I S Y F L L I I F V G L A M S L T V N V D A S P V V R L S K P V S G L L R L F G N M Y A G E L I F I L I A G L L K M K G A F F F I G G T K E L T L Q N H W P I V L E G V N L I S L L Y V I T L M V F I F A Q L T I I L I H F I A W P V N L I L S M A H HH HH H C P WW S Q W A L P G Y I A E H V L P interaction avec c interaction avec b

25 F17 F14 Q10 T6 N4 W26 (cycle // mb) P27-28 (torsion 30°) organisation dimérique de la sous-unité b hélice N-terminale transmembranaire (mutagenèse cystéines et pontage) [daprès Dmitriev O., Jones P.C., Jiang W. et Fillingame R.H., J. Biol. Chem. (1999) 274, ]

26 sous-unité b, ATPsynthase E.coli 81 KRRSQILDEA KAEAEQERTK IVAQAQAEIE AERKRAREEL 1 MNLNATILGQ AIAFVLFVLF CMKYVWPPLM AAIEKRQKEI interface du dimère cluster aromatique Hélice transmembranaire pas de pontage cycle parallèle à la membrane torsion rigide 30° début hélice soluble Réf. 1 ADGLASAERA HKDLDLAKAS ATDQLKKAKA EAQVIIEQAN 41 zone où des délétions importantes peuvent être faites sans dommages Réf.2 tronquer jusquici nempêche pas la dimérisation Réf.3 tronquer jusquici empêche la dimérisation Réf.3 pontages XnC dimériques Réf.3 XnC ne ponte pas Réf.4 RKQVAILAVA GAEKIIERSV DEAANSDIVD KLVAEL121 XnC pontages dimériques Réf.4 Réf.5 inteface dimère Réfs.4-6 XnC pontages dimériques Réf.3 E155C pontage avec Réf.7 Réf. 1 Dmitriev et al. (1999) JBC 274, ; fragment N-terminal; RMN, mutagenèse, pontage et modélisation Réf. 2 Sorgen et al. (1998) JBC 273, ; complexe entier, délétion, tests fonctionnels Réf. 3 McLachlin & Dunn (1997) JBC 272, ; tronquage N-terminal, mutagenèse et pontage, chromatographie daffinité, ultracentrifugation Réf.4 Rodgers et al. (1997) JBC 272, ; domaine soluble, mutagenèse et pontage, dichroïsme circulaire Réf. 5 Rodgers & Capaldi (1998) JBC 273, ; complexe entier, mutagenèse et pontage, tests fonctionnels Réf. 6 Howitt et al. (1996) JBC 271, , domaine soluble, mutagenèse (sans pontage), ultracentrifugation Réf. 7 McLachlin et al. (1998) JBC 273, ; domaine soluble, mutagenèse et pontage L156C pontage avec et découple Réf.5

27 membrane contact avec et (sommet du complexe F 0 F 1 ) contact avec a dimérisation 2, 6, 10 P pontage 59, 60, 61, 65, 67 heptades peut être raccourci (-2, -4, -7) peut être rallongé (+7,+11,+14) peut être rendu boiteux (+7,-7) dimère de sous-unité b (E.coli) (modèle largement spéculatif) heptades pontage 84, 104 pontage 124 pontage 128,131,132,140 pontage 144, 146 le pédoncule latéral de l'ATP synthase de E.coli serait plutôt flexible

28 Sous-unité b Sous-unité d Sous-unité F6 Sous-unité b Nter côté matriciel Structure RX du complexe b-d-F6 (mitochondrie animale) membrane [daprès Dickson, K., Silvester, J. A., Fearnley, I. A., Leslie, A.G.W. et Walker, J.E. (2006) EMBO J. 25, ] le pédoncule latéral de l'ATP synthase mitochondriale serait plutôt rigide

29 Localisation et fonction des ATP synthases Structure générale des ATP synthases et aperçu du mécanisme Les hypothèses fondatrices sur le mécanisme Lhypothèse du proton substrat Le mécanisme de changement daffinité Structure détaillée de la partie F 1 Les sites nucléotidiques Laxe central Structure de la partie F 0 Architecture du complexe F 0 F 1 Structure de la sous-unité c Structure de la sous-unité a Structure de la sous-unité b Mécanisme de la partie F 1 Evidence biochimique de la rotation Visualisation de la rotation Etats catalytiques, occupation des sites et étapes du mouvement rotatif Mécanisme de la partie F 0 Couplage entre F 0 et F 1 Stoechiométrie H + /ATP nombre de sous-unités c Elasticité et problèmes connexes Régulation de lactivité des ATP synthases Le cas des chloroplastes Le cas de E.coli Existe-t-il des cliquets moléculaires? Comparaison E.coli -chloroplaste Le cas des mitochondries Le peptide inhibiteur IF1 Les V-ATPases Structure générale des V-ATPases Les sous-unités c des V-ATPases Fonctions des V-ATPases Stoechiométrie H + /ATP: une affaire de pignon Les hélicases hexamériques

30 SH S SH S oxydation S S Dissociation des sous-unités S SH S * * Réassociation avec des sous-unités radioactives S S S S * S S * Dissociation des sous-unités séparation comptage radioactif [daprès: Duncan T.M., Bulygin V.V., Zhou Y., Hutcheon M.L. et Cross R.L., Proc. Natl Acad. Sci. USA (1995) 92, ] * S S * SH * SH * SH * Réduction turnover catalytique (+ATP) oxydation S S S S *

31 Sens de rotation de l'ATP synthase vide.AMPPNP.ADP synthèse d'ATP vers membrane a) Prédit par l'occupation des sites dans le cristal de MF 1 b) Observé lors de l'hydrolyse d'ATP par le TF 1 ou le EF 0 EF 1 vers membrane [D après Noji H., Yasuda R., Yoshida M. et Kinosita K., Nature (1997) 386, ] [Daprès Sambongi Y., Iko Y., Tanabe M., Omote H., Iwamoto-Kihara A., Ueda I., Yanagida T. et Wada Y., Science (1999) 286, ] Ni-NTA sur plaque de verre streptavidine His-tag Actine fluorescente Sous-unité Sous-unités c

32 Actine fluorescente [D après Noji H., Yasuda R., Yoshida M. et Kinosita K., Nature (1997) 386, ] Petit fluorochrome Lumière polarisée Sous-unité V H [Daprès Adachi K., Yasuda R., Noji H., Itoh H., Harada Y., Yoshida M. et Kinosita K., Proc. Natl Acad. Sci. USA. (2000) 97, ]

33 [daprès Yasuda R., Noji H., Yoshida M., Kinosita K. et Itoh H., Nature (2001) 410, ] BSA Bille (or colloïdal) détection intervalles de temps: 0,5 ms

34 ROTATION DE ET CYCLE CATALYTIQUE (HYDROLYSE D ATP) ATP fort ATP moyen ATP faible 360° temps 2/ détection directe de la rotation de en molécule unique de TF 1 [daprès Yasuda R., Noji H., Yoshida M., Kinosita K. et Itoh H., Nature (2001) 410, ]

35 [daprès Itoh H., Takahashi A., Adachi K., Noji H., Yasuda R., Yoshida M. et Kinosita K., Nature (2004) 427, ] h ATP + luciférine + O 2 + AMP + PPi + oxyluciférine + CO 2 LL B bille magnétique Ø 700 nm échantillon observation électro-aimants

36 détection par réflection détection par fluorescence (lumière polarisée tournante) [daprès Nishizaka T., Oiwa K., Noji H., Kimura S., Muneyuki E., Yoshida M et Kinosita K., Nat. Struct. Mol. Biol. (2004) 11, ]

37 Rotation due à la force protomotrice [daprès Zhang Y., Wang J., Cui Y., Yue J. et Fang X., Biochem. Biophys. Res. Commun. 331 (2005) ] suppression de la sous-unité H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ bactériorhodopsine LIPOSOME libre rotation de

38 ATP hyd ADP + P 80° 40° ADP + P ATP 80° tri-site bi-site Le mécanisme d'hydrolyse (et de synthèse) d'ATP est-il "tri-site" ou "bi-site"?

39 occupation des sites nucléotidiques dans les cristaux de MF 1 MF 1 de coeur de boeuf cristallisé dans D 2 O en présence dazide, dAMP-PNP, dADP (non saturant) et de Mg 2+ MF 1 de foie de rat cristallisé dans H 2 O en présence dATP et de P i AMP- PNP Mg AMP- PNP Mg AMP- PNP Mg AMP- PNP Mg ADP Mg ATP Mg ADP P i ATP Mg ATP Mg ADP P i MF 1 de coeur de boeuf cristallisé dans D 2 O en présence dAMP-PNP, dADP, de fluoroaluminate, de sulfate et de Mg 2+ AMP- PNP Mg AMP- PNP Mg AMP- PNP Mg ADP Mg AlF 4 ADP SO 4 Mg ADP Mg AlF 4 site fermé site « semi-fermé » site ouvert [Daprès Abrahams J.P., Leslie A.G., Lutter R. et Walker J.E., Nature (1994) 370, ] [Daprès Bianchet M.A., Hullihen J., Pedersen P.L. et Amzel L.M., Proc. Natl Acad. Sci. USA (1998) 95, ] [Daprès Menz R.I., Walker J.E. et Leslie A.G., Cell (2001) 106, ]

40 Tyr345 (MF 1 ) ATP Stacking de lATP avec la Tyr 345 du site catalytique (ATPsynthase mitochondriale), homologue de Tyr 331 de E.coli Y331 ou W331+ATP saturant W331 Fluorescence du mutant bW331 (Tyr Trp et extinction par la fixation de nucléotides aux sites catalytiques (E.coli) Vitesse d hydrolyse d ATP en fonction du nombre de sites occupés (E.coli) [Daprès Weber J., Wilke-Mounts S., Hammond S.T. et Senior A.E., Biochemistry (1998) 37, et Lobau S., Weber J. et Senior A.E., Biochemistry (1998) 37, ]

41 PPi ANP PPi PPi ANP ATP ADP + P système enzymatique régénérant l'ATP F 1 -ATPase mesure des nucléotides libres mesure de la vitesse d'hydrolyse d'ATP calcul des nucléotides liés sites catalytiques occupés [ANP] libre, µM V / V max [Daprès Milgrom Y.M. et Cross R.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 102, ]

42 Scénario pour la synthèse dATP

43 Localisation et fonction des ATP synthases Structure générale des ATP synthases et aperçu du mécanisme Les hypothèses fondatrices sur le mécanisme Lhypothèse du proton substrat Le mécanisme de changement daffinité Structure détaillée de la partie F 1 Les sites nucléotidiques Laxe central Structure de la partie F 0 Architecture du complexe F 0 F 1 Structure de la sous-unité c Structure de la sous-unité a Structure de la sous-unité b Mécanisme de la partie F 1 Evidence biochimique de la rotation Visualisation de la rotation Etats catalytiques, occupation des sites et étapes du mouvement rotatif Mécanisme de la partie F 0 Couplage entre F 0 et F 1 Stoechiométrie H + /ATP nombre de sous-unités c Elasticité et problèmes connexes Régulation de lactivité des ATP synthases Le cas des chloroplastes Le cas de E.coli Existe-t-il des cliquets moléculaires? Comparaison E.coli -chloroplaste Le cas des mitochondries Le peptide inhibiteur IF1 Les V-ATPases Structure générale des V-ATPases Les sous-unités c des V-ATPases Fonctions des V-ATPases Stoechiométrie H + /ATP: une affaire de pignon Les hélicases hexamériques

44 Mécanisme de rotation basé sur la combinaison du mouvement brownien et des contraintes électrostatiques [daprès Junge W., Lill H. et Engelbrecht S., Trends Biochem. Sci. (1997) 22, ] mécanisme possible par torsion proton-induite de la sous-unité c [Daprès Rastogi V.K. et Girvin M.E., Nature (1999) 402, ] P43 F54 Y73 D61 A24 P43 F54 Y73 D61 A24 pH 8 pH 5 H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ déprotoné protoné

45 La 4 ème hélice de la sous-unité a (stator) pourrait jouer un rôle particulier dans la canalisation des protons [Daprès Fillingame R.H., Angevine C. M. & Dmitriev O. Y., Biochim. Biophys. Acta (2002) 1555, 29-36)] R210 résidus accessible à Ag + après mutation en cystéine résidus accessible à Ag + et NEM après mutation en cystéine

46 [Daprès Fillingame R.H., Angevine C. M. & Dmitriev O. Y., Biochim. Biophys. Acta (2002) 1555, 29-36)] rotation concertée c-H2 rotation a-H4 mouvement des sous- unités c + conformation « bas pH » conformation « haut pH » déprotonation de c + conformation « bas pH » conformation «haut pH» contrainte CYTOPLASME PÉRIPLASME tunnel côté cytoplasme cH1 cH2 cH1 cH2 aH4 rotation de aH4 + conformation « bas pH » conformation « haut pH » tunnel côté périplasme conformation « bas pH » protonation de c + + conformation « haut pH » conformation « bas pH » = Arg210 Asp61

47 Localisation et fonction des ATP synthases Structure générale des ATP synthases et aperçu du mécanisme Les hypothèses fondatrices sur le mécanisme Lhypothèse du proton substrat Le mécanisme de changement daffinité Structure détaillée de la partie F 1 Les sites nucléotidiques Laxe central Structure de la partie F 0 Architecture du complexe F 0 F 1 Structure de la sous-unité c Structure de la sous-unité a Structure de la sous-unité b Mécanisme de la partie F 1 Evidence biochimique de la rotation Visualisation de la rotation Etats catalytiques, occupation des sites et étapes du mouvement rotatif Mécanisme de la partie F 0 Couplage entre F 0 et F 1 Stoechiométrie H + /ATP nombre de sous-unités c Elasticité et problèmes connexes Régulation de lactivité des ATP synthases Le cas des chloroplastes Le cas de E.coli Existe-t-il des cliquets moléculaires? Comparaison E.coli -chloroplaste Le cas des mitochondries Le peptide inhibiteur IF1 Les V-ATPases Structure générale des V-ATPases Les sous-unités c des V-ATPases Fonctions des V-ATPases Stoechiométrie H + /ATP: une affaire de pignon Les hélicases hexamériques

48

49 H+H+ H+H+ ADP + PATP + H 2 O H + G p c c c c H + = F - 2,3 RT pH G p = G RT log [ATP] [ADP][P i ] Equilibre: Gp = n H + ~ ~ ~

50 ADP + P ATP ADP + P ATP ADP Transfert délectrons µ H + lumière ADP + P Différents régimes fonctionnels de lATP synthase (thylacoïdes isolés)

51

52

53 Nombre de sous-unités c Structure 3D de MF 0 MF 1 de levure [daprès Stock D., Leslie A.G. et Walker J.E., Science (1999) 286, ] n= Cristal 2D de sous-unités c de CF 0 CF 1. Microscopie de force atomique [daprès Seelert H., Poetsch A., Dencher N.A., Engel A., Stahlberg H. et Müller, D. J., Nature (2000) 405, ] n=14 Cristal 2D de sous-unités c de Ilyobacter Tartaricus. Microscopie électronique par transmission [daprès Stahlberg H., Müller D.J., Suda K., Fotiadis D., Engel A., Meier T., Matthey U. et Dimroth P., EMBO Rep.(2001)2, ] n=11

54 nm Cristal 2D de sous-unités c de F 0 F 1 de Spirulina platensis Microscopie de force atomique [daprès Pogoryelov D., Yu J., Meier T., Vonck J., Peter P. & Muller D. J., EMBO Reports (2005)] n=15

55 c total puits dénergie LE FAIT QUE LE NOMBRE DE SOUS-UNITES c NE SOIT PAS UN MULTIPLE DE 3 AMELIORE-T-IL LES PERFORMANCES CINETIQUES? 9 sous-unités c rotation c total rotation puits dénergie 10 sous-unités c

56 rotation partielle de 3 3 torsion de b translocation de H + rotation de c 10 rotation partielle et torsion de 3-4 H (Mg)ADP + P (Mg)ATP + H 2 O 3 relaxation de retour de 3 3 relaxation de b fixation dADP libération dATP

57 Localisation et fonction des ATP synthases Structure générale des ATP synthases et aperçu du mécanisme Les hypothèses fondatrices sur le mécanisme Lhypothèse du proton substrat Le mécanisme de changement daffinité Structure détaillée de la partie F 1 Les sites nucléotidiques Laxe central Structure de la partie F 0 Architecture du complexe F 0 F 1 Structure de la sous-unité c Structure de la sous-unité a Structure de la sous-unité b Mécanisme de la partie F 1 Evidence biochimique de la rotation Visualisation de la rotation Etats catalytiques, occupation des sites et étapes du mouvement rotatif Mécanisme de la partie F 0 Couplage entre F 0 et F 1 Stoechiométrie H + /ATP nombre de sous-unités c Elasticité et problèmes connexes Régulation de lactivité des ATP synthases Le cas des chloroplastes Le cas de E.coli Existe-t-il des cliquets moléculaires? Comparaison E.coli -chloroplaste Le cas des mitochondries Le peptide inhibiteur IF1 Les V-ATPases Structure générale des V-ATPases Les sous-unités c des V-ATPases Fonctions des V-ATPases Stoechiométrie H + /ATP: une affaire de pignon Les hélicases hexamériques

58 E inactif E actif µ H + ~ ~ ADP +P i ATP Le gradient électrochimique de protons a un double rôle: activateur et énergétique Evènements liés à lactivation: Changements structuraux de et (CF 0 CF 1 ) Expulsion d ADP fortement lié (CF 0 CF 1 ) Dissociation ou changement de position du peptide IF1 (MF 0 MF 1 ) Facteurs synergiques: Nucléotides non catalytiques ? Réduction de la sous-unité (CF 0 CF 1 ) E inactif : ATP synthase inactive en synthèse comme en hydrolyse d ATP 100 % 0 amplitude du gradient de protons proportion dATPases activées

59 100 % 0 amplitude du gradient de protons proportion dATPases activées oxydé réduit La réduction de la sous-unité, catalysée par une thiorédoxine, facilite lactivation de lATPase thiorédoxine oxydée (E.coli) thiorédoxine réduite domaine d interaction avec la thiorédoxine (spécifique du CF 1, structure non résolue) pédoncule externe (stator)

60 masqué ATPsynthase désactivée démasqué ATPsynthase activée par le gradient de protons Une hypothèse de démasquage du site de fixation de la thiorédoxine en accord avec le mécanisme rotatif ATPsynthase synthétisant de lATP alternativement masqué et démasqué [Daprès He, X., Miginiac-Maslow, M.., Sigalat, C., Keryer, E. et Haraux, F., J. Biol. Chem. (2000) 275, ]

61 LA SOUS-UNITE bactérienne et chloroplastique est-elle un cliquet moléculaire? [D après Tsunoda S.P., Rodgers A.J., Aggeler R., Wilce M.C., Yoshida M. et Capaldi R.A., Proc Natl Acad. Sci. USA (2001) 98, ]

62 ENLEVER LES RESIDUS CORRESPONDANTS DE LA SOUS-UNITE DE LATP SYNTHASE CHLOROPLASTIQUE N AFFECTE PAS LA FONCTION ATP SYNTHASE, MAIS DIMINUE LE POUVOIR INHIBITEUR DE (Nowak et al., Biochemistry 41 (2002), ) CONFIRMATION DU RÔLE REGULATEUR DE LA PARTIE C-TERMINALE DE LA SOUS-UNITE BACTERIENNE ET CHLOROPLASTIQUE DANS E.COLI, NE GARDER QUE CETTE PARTIE DE CONSERVE AU MOINS PARTIELLEMENT SON EFFET INHIBITEUR SI LON NE GARDE QUE CETTE PARTIE DE LATP SYNTHASE RESTE FONCTIONNELLE MAIS N EST PLUS INHIBITEUR (Kuki et al., J. Biol.Chem. 263 (1988), )

63 REGULATION DES ATP SYNTHASES DE E.COLI ET DE CHLOROPLASTE Dans E.coli, la régulation fait intervenir la sous-unité, qui peut exister au moins sous deux conformations différentes, haute et basse, de sa partie C-terminale. En conformation haute, lhydrolyse dATP est inhibée, mais pas sa synthèse. LADP et le gradient de protons favoriseraient la position haute. LATP favoriserait la position basse. Un détecteur d ATP pourrait être présent sur la sous-unité. Dans lATPase chloroplastique, la sous-unité inhibe lhydrolyse dATP, également par sa partie C-terminale. Le gradient de protons favorise lactivation de lenzyme, à la fois pour la synthèse et lhydrolyse dATP. Lhydrolyse d ATP est totalement inhibée en absence de gradient de protons. LADP, ajouté directement ou provenant de l hydrolyse d ATP, est inhibiteur. La régulation fait également intervenir la sous-unité. La réduction du pont disulfure de favorise lactivation de lenzyme. Dans les membranes, cette activation (ou levée dinhibition) porterait à la fois sur la synthèse et lhydrolyse de lATP. La réduction de a probablement deux effets activateurs différents: un effet direct dû à un changement de conformation de, et un effet indirect de sur la sous-unité diminuant son pouvoir inhibiteur. Il ny a pas encore dinterprétation structurale de ces effets. La fonction de cette régulation pourrait être dadapter lATP synthase aux besoins de la cellule, en lui faisant, selon les conditions, synthétiser de lATP ou maintenir le gradient de protons à travers la membrane cytoplasmique si celui-ci tend à diminuer. Mais par ailleurs, la disparition totale du gradient de protons conduit à linactivation de lATPase en présence dADP, ce qui est paradoxal. La fonction de cette régulation pourrait être déviter lhydrolyse de lATP en inactivant lenzyme durant les périodes où la chaîne de transfert délectrons ne génère pas de force protomotrice, par exemple la nuit. Toutefois, le rôle de la forme oxydée et de la forme réduite nest pas clair. In vivo, la forme réduite pourrait être constamment active. Conclusion: malgré la parenté structurale et fonctionnelle évidente entre les sous-unités bactérienne et chloroplastique, les modalités de la régulation de lactivité ATPasique peuvent différer notablement. De plus, cette régulation na peut-être pas le même rôle physiologique dans ces deux systèmes.

64 c 10 c 10 IF1 Dans le cas de l'ATPase mitochondriale, seule existe la configuration où les deux hélices de la sous-unité sont plaquées sur la couronne des sous-unités c. Cette configuration est non inhibitrice. Même si les hélices avaient envie de basculer vers le haut, la présence de la sous-unité additionnelle les en empêche. Dans ce cas, le rôle inhibiteur est rempli par une sous-unité dissociable, IF1 La force protomotrice (ou la rotation de lenzyme dans le sens de la synthèse d ATP?) favorise la dissociation de IF1, ou éventuellement sa fixation sur un site non inhibiteur. La dissipation de la force protomotrice (ou plutôt la rotation dans le sens de l hydrolyse?) entraîne linhibition. INHIBITION DES F 1 -ATPases MITOCHONDRIALES

65 LES EFFECTEURS CONNUS DE LINTERACTION IF1-MF 0 MF 1 force protomotrice pH élevé ATP pH faible

66 IF DP E E TP DP IF Gledhill, J. R.., Montgomery, M.G., Leslie, G. W. & Walker, J. E. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104,

67 REGULATION DES ATP SYNTHASES MITOCHONDRIALES Dans les mitochondries, lhydrolyse d ATP est inhibée par un peptide inhibiteur appelé IF1. IF1 inhibe lATPase de façon stoechiométrique. Linhibiteur IF1 (de boeuf) se fixe sur l ATPase à l interface et interagit aussi avec, quoique plus faiblement. La composante électrique du gradient de protons ( ) favorise la dissociation de IF1. Un pH élevé favorise la dissociation de IF1. LATPase ne peut fixer IF1 que si elle est en train dhydrolyser de l ATP. Il a été proposé que IF1 pourrait rester fixé sur lATP synthase en ninhibant que lhydrolyse de lATP, mais pas sa synthèse. Propriétés spécifiques au modèle bovin Le peptide IF1 de boeuf existe sous forme dimérique et tétramérique. Le tétramère serait inactif. Un pH élevé favorise la tétramérisation du IF1. In vitro (sous-complexe MF1 purifié), la fixation de IF1 favorise la formation de dimères dATPase. Cette propriété n est pas nécessairement extrapolable au complexe lié à la membrane. Propriétés spécifiques au modèle levure Saccharomyces cerevisiae possède deux peptides inhibiteurs de lATPase mitochondriale, IF1 et STF1. Leurs séquences sont très proches. Les propriétés doligomérisation de ces deux peptides sont différentes de celles du IF1 de boeuf. La seule différence fonctionnelle claire entre IF1 et STF1 est que laffinité de STF1 pour lATP synthase est nettement plus faible que celle de IF1. A lheure actuelle, personne ne sait à quoi sert STF1, ni même sil sert à quelque chose. Le rôle physiologique de linhibition de lhydrolyse dATP par IF1 pourrait être déviter lhydrolyse dATP lors darrêts de la chaîne respiratoire. Cependant, dautres phénomènes limitent déjà sévèrement lhydrolyse de lATP dans les mitochondries. IF1 pourrait devenir réellement nécessaire si la membrane mitochondriale devenait in vivo très perméable aux protons (ouverture du «MPT», situations pré- apoptotiques, etc). On pourrait imaginer que IF1, en empêchant la génération dun gradient de protons lors darrêts de la chaîne respiratoire, limite lapparition de radicaux libres.

68 Localisation et fonction des ATP synthases Structure générale des ATP synthases et aperçu du mécanisme Les hypothèses fondatrices sur le mécanisme Lhypothèse du proton substrat Le mécanisme de changement daffinité Structure détaillée de la partie F 1 Les sites nucléotidiques Laxe central Structure de la partie F 0 Architecture du complexe F 0 F 1 Structure de la sous-unité c Structure de la sous-unité a Structure de la sous-unité b Mécanisme de la partie F 1 Evidence biochimique de la rotation Visualisation de la rotation Etats catalytiques, occupation des sites et étapes du mouvement rotatif Mécanisme de la partie F 0 Couplage entre F 0 et F 1 Stoechiométrie H + /ATP nombre de sous-unités c Elasticité et problèmes connexes Régulation de lactivité des ATP synthases Le cas des chloroplastes Le cas de E.coli Existe-t-il des cliquets moléculaires? Comparaison E.coli -chloroplaste Le cas des mitochondries Le peptide inhibiteur IF1 Les V-ATPases Structure générale des V-ATPases Les sous-unités c des V-ATPases Fonctions des V-ATPases Stoechiométrie H + /ATP: une affaire de pignon Les hélicases hexamériques

69 V0V0 V1V1 Modèle structural de lATPase des vésicules tapissées [daprès Arata Y., Nishi T., Kawasaki-Nishi S., Shao E., Wilkens S. & Forgac M., Biochim. Biophys. Acta (2001) 1555, 71-74] Les cousins proches: les ATPases vacuolaires et apparentées U I U U I sous-unité c - type V 0 (6 copies) type F 0 ou A 0 (9-12 copies) U II - Structure de lATPase de Clostridium fervidus vue en microscopie électronique [Daprès Boekema E.J., Ubbink-Kok T., Lolkema J.S., Brisson A. et Konings W.N., Proc. Natl Acad. Sci. USA. (1997) 94, ] H C B A B A a E d B D A G2G2 c 4 cc F

70 c c c c c b F-ATPase a V-ATPase c c A B B c c G E d F A A D B c c C H a c 4-5 cc adapté daprès [Wilkens S., Inoue T. et Forgac M. (2004) J. Biol. Chem. 279, ] appartiennent au rotor (expérience de rotation) structure de la sous-unité C (Iwata M., Imamura H., Stambouli E., Ikeda C., Tamakoshi M., NagataK., Makyio H., Hankamer B., Barber J., Yoshida M., Yokoyama K. et Iwata S. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 59-64) C non essentielle pour lassemblage (rôle activateur ?) appartient au pédoncule périphérique pour tout le monde, sauf pour un groupe qui pense quelle appartient à laxe central (Lolkema J. S., Chaban Y. et Boekema E. (2003) J. Bioenerg. Biomembr. 35, ; Chaban Y. L., Coskun Ü, Keegstra W., Oostergetel G. T., Boekema E. J. et Grüber G. (2004) J. Biol. Chem., sous presse appartient au stator (expérience de rotation) structure de la sous-unité H (Sagerann M., Stevens T. H. et Matthews B. W. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, ) H

71 c c c c c a b F 1 et F 0 actifs Dissociation F 0 F 1 biochimique c c c c c a b H + ATP i ADP+P c c A B B c c G E d F A A D B c c C H a Dissociation V 0 V 1 physiologique A B B G F A A D B H c c c c d c c a E C ? ? V 1 et V 0 inactifs

72 F D B A A bille His-Tag [daprès Imamura H., Nakano M., Noji H., Muneyuki E., Ohkuma S., et Yoshida M. et Yokoyama K. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, ] intervalles de temps: 33 ms c A B B c G E F A A D B c a His-Tag [daprès Hirata T., Iwamoto-Kihara A., Sun- Wada G.-H., Okajima T, Wada Y. et Futai M. (2003) J. Biol. Chem. 278, ] actine intervalles de temps: 10 ms

73 côté V1 La sous-unité c de la V-ATPase de S. cerevisiae E137 A A G I I I Y G L V 70V S S V V L C Y A K S G V GICATCVLRP D L50 L F K T G N I V P Y A A G V I M L S T F I I A A A S C G G I F F P P A Y V M T E L C L G 80Q K Q A L Y T G F I Q90 L G A G G L S V L S100 G L A A G F A I G I 110 V G D A G V R G S S Q Q P R L F V G I 130 L L L F A V G 140 L L Y G I V A L L L N S R A T Q D V V C 160 I I M sous-unité c [Daprès Nelson N. et Harvey W.R., Physiol. Rev. (1999) 79, ]

74 Quelques fonctions des ATPases de type V 1. Dans la membrane cytoplasmique de certaines cellules. è Energisation de la membrane apicale de lépithélium de lintestin moyen chez les Lépidoptères. Excrétion de potassium par un échangeurélectrophorétique H + /K + è Energisation de la membrane apicale de lépiderme de grenouille. Absorption de Na + par unantiportH + /Na +, et du Cl - par un échangeur électrophorétique Cl - /HCO 3 - è Excrétion dions H + de plusieurs types de cellules : cellules rénales, macrophages, ostéoclastes. è Acidification desphagosomes (activation des protéases et des lipases). è Acidification des vésiculeschromaffines et des vésicules synaptiques conduisant à laccumulation de neurotransmetteurs. è Energisation de la membrane des vacuoles de plantes pour effectuer des transports secondaires (Na +, Ca 2+, métabolites). è Acidification desendosomes (dissociation pH-dépendante des ligands de leurs récepteurs). è Acidification des lysosomes (activation des réactions de dégradation). Quelques modes de régulation des ATPases de type V è Régulationrédox : pontage de deux cystéines situées dans les sous-unités catalytiques. La forme oxydée (pontée) est inactive. è Dissociation réversible de la partie V 0 et de la partie V 1, produisant deux sous-complexes inactifs. è Interaction avec des effecteurs spécifiques. 2. Dans les différents compartiments cellulaires

75 lumen ATPADP + P i H+H+ 2 H + K+K+ cellule épithéliale Déconnexion de V 0 et V 1 dans lépithélium de lintestin moyen dune chenille durant la mue [daprès Sumner J.P., Dow J.A., Earley F.G., Klein U., Jager D. et Wieczorek H., J. Biol. Chem. (1995) 270, ] (La chenille photographiée nest pas de la même espèce que celle de lexpérience; elle provient dun site WEB:

76 RER Golgi vésicule de tri lysosome vésicule dendocytose vésicule dexocytose recyclage des récepteurs vésicule de transport recyclage des récepteurs Vésicules et trafic cellulaire

77 H+H+ H+H+ Cl - H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ vésicule tapissée endosome précoce endosome tardif lysosome pH 5 compartiment de découplage ligand- récepteur pH 5,5 fusion recyclage des récepteurs membrane plasmique [daprès Forgac M., Adv. Mol. Cell Biol. (1998) 23B, ]

78 clathrine récepteur ligand membrane adaptateur V-ATPase Un modèle (contesté) d internalisation de la V-ATPase lors des étapes précoces de lendocytose [daprès Forgac M., Adv. Mol. Cell Biol. (1998) 23B, ]

79 La stoechiométrie H + /ATP: une affaire de pignon ? pignon à 6 dents sous-unité de type ATPase vacuolaire groupe protonable modèle biochimique à 6 groupes protonables sous-unité de type ATP synthase groupe protonable pignon à 12 dents modèle biochimique à 12 groupes protonables

80 Glu139 Le rotor de la V-ATPase dEnterococcus hirae contient dix segments protonables [Murata T., Yamato I., Kakinuma Y., Leslie A.G. & Walker J.E. Science (2005) 308, ]

81 Localisation et fonction des ATP synthases Structure générale des ATP synthases et aperçu du mécanisme Les hypothèses fondatrices sur le mécanisme Lhypothèse du proton substrat Le mécanisme de changement daffinité Structure détaillée de la partie F 1 Les sites nucléotidiques Laxe central Structure de la partie F 0 Architecture du complexe F 0 F 1 Structure de la sous-unité c Structure de la sous-unité a Structure de la sous-unité b Mécanisme de la partie F 1 Evidence biochimique de la rotation Visualisation de la rotation Etats catalytiques, occupation des sites et étapes du mouvement rotatif Mécanisme de la partie F 0 Couplage entre F 0 et F 1 Stoechiométrie H + /ATP nombre de sous-unités c Elasticité et problèmes connexes Régulation de lactivité des ATP synthases Le cas des chloroplastes Le cas de E.coli Existe-t-il des cliquets moléculaires? Comparaison E.coli -chloroplaste Le cas des mitochondries Le peptide inhibiteur IF1 Les V-ATPases Structure générale des V-ATPases Les sous-unités c des V-ATPases Fonctions des V-ATPases Stoechiométrie H + /ATP: une affaire de pignon Les hélicases hexamériques

82 Les cousins éloignés: les hélicases hélicase hexamérique de papillomavirus [daprès Fouts E.T., Yu X., Egelman E.H. et Botchan M.R., J. Biol. Chem. (1999) 274, ] 5 3 H2OH2O ATP ADP + P i ATP ADP + P i ATP Changement de conformation Une hélicase hexamérique au travail [Daprès Ahnert P. et Patel S.S., J Biol Chem. (1997) 272, ] Mécanisme proposé pour une hélicase hexamérique, comparable à celui de la F 1 - ATPase [daprès Hingorani M.M., Washington M.T., Moore K.C. et Patel S.S., Proc. Natl Acad. Sci. USA. (1997) 94, ]

83

84 ?

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89 brin retardé brin direct protéines fragment d'Okazaki polymérase clamp Facteur primase polymérase hélicase La fourche de réplication (ou réplisome en langage moderne) est composée de moteurs moléculaires synchronisés

90 Léonard de Vinci ( ) Etude des vertèbres cervicales de la base du crâne (Royal Collection, Londres) Etude des vertèbres cervicales; analogie avec un mât de navire (Royal Collection, Londres)


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