Gènes des Immunoglobulines. Rappels: Immunité naturelle / Immunité adaptative Immunité naturelleImmunité adaptative Composants 1) Revêtements cutanéo-muqueux.

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1 Gènes des Immunoglobulines

2 Rappels: Immunité naturelle / Immunité adaptative Immunité naturelleImmunité adaptative Composants 1) Revêtements cutanéo-muqueux + sécrétions 2) Phagocytes: - Polynucléaires - Macrophages (Monocytes) - Cellules NK 3) Système enzymatique: complément Lymphocytes B Lymphocytes T Récepteurs - Lectines - TLR (récepteur de la famille des Toll) - Récepteurs à 7 domaines Tm - Complément (Fragment C3b soluble) LT TcR (membranaire) LB BcR (membranaire) Ig (soluble) Antigènes PAMPs (Pathogen-associated molecular patterns): -Peptides formylés (R à 7 domaines Tm) - ADN CpG (TLR) - Polysaccharides et peptidoglycanes (Lectines et TLR) - ARN db (TLR) Multitude Mise en place ImmédiateLente lors de la première exposition Caractéristiques -Mémoire: - Intensification de la réponse lors d'une seconde exposition - Maturation de l’affinité

3 « Jaw Hypothesis » Prédation Acquisition de la machoire Agnathes (500 millions d’années) Gnathostomes (410 millions d’années)

4 LYMPHOCYTE T TcR Reconnaissance de l’antigène par le TcR. Le TcR des lymphocytes T ne peut reconnaître l’antigène que sous forme de peptide pésenté par les molécules HLA du « soi ». La dégradation de l’antigène et sa manipulation (processing) à lieu dans les cellules présentatrices (CPA: Cellules présentant l’antigène) TcR Peptide HLA CPA Antigène LYMPHOCYTE T Rappels: Récepteurs T pour l’antigène

5 Rappels: Récepteurs B pour l’antigène LYMPHOCYTE B BcR ou Ig membranaire Anticorps ou Ig solubles PLASMOCYTE Activation Maturation Prolifération Antigène Immunoglobuline ou Anticorps Paratope Epitope Clone 2 Clone 3 Clone 1 Ac 2 Ac 3Ac 1 Reconnaissance de l’antigène par les BcR et les anticorps

6 CH1 VH CH3 CH2 CH3 CH2 CL VL Chaîne légère Chaîne lourde NH2 COOH Région hypervariables CDR1 à CDR3 Sucre Site de liaison du complément Zone charnière Fc Médiateur des activités biologiques Fab Médiateur de la liaison antigénique Rappels: Structure d’une immunoglobuline Immunoglobuline = Glycoprotéine H2L2 (2Fab+1Fc)

7 Kiel MJ, Morrison SJ. Nat Rev Immunol. 2008 Apr;8(4):290-301. Epub 2008 Mar 7. Review a- Contact direct cellule-cellule b- Sécrétion de facteurs solubles c- Régulation des fonctions de cellules intermédiaires Facteurs Solubles Cellules intermédiaires Cellules endostéales Cellules de l’endoste et niches hématopoïétiques Les cellules endostéales sécrètent des facteurs qui réguleraient la ocalisation et le maintien des niches de CSH: - Elles constitueraient une niche et les CSH seraient en contacte directe avec les ostéoblastes - Elles sécrèteraient des facteurs solubles qui réguleraient les CSH résidante dans un microenvironnement périvasculaire proche de l’endoste. - Elles assureraient le maintien des CSH en régulant les fonctions de cellules intermédiaires qui assureraient la création de l’environnement favorable pour l’établissement des niches (rôle des ostéoblates dans la vascularisation). CSH

8 HSC: hematopoietic stem cell MPP: multipotent progenitor LMPP: lymphoid-primed MPP HSCMPPLMPP CMP Erythroïde Myeloïde Périphérie Curr Opin Immunol. 2010 Apr;22(2):177-84. Epub 2010 Mar 6. Review. Cellules T ELPCLPCellule B « biaisée » Cellule Pré-B Cellule Pro-B Cellule B immature Cellule B mature ETP ELP: early lymphoid progenitor CLP: common lymphoid progenitor ETP: early T lineage progenitor Hématopoïèse, Lymphopoïèse et facteurs de transcription

9 Organe lymphoïde secondaire CentroblasteCentrocytePlasmocyte Thymus Thymocyte immature DN Thymocyte commun DP Progéniteur lymphoïde commun Leucémie à LGL LAL ProB LAL PréB LAL B LAL commune LPL, HCL, MCL certaines LLC Lymphomes malins non hodgkiniens B Certaines LLC Myélome Waldenström LAL T communes LAL T immatures LAL T matures Lymphome lymphoblastique Lymphomes malins T périphériques LLC T, Mycosis fungoïde, Sézary Lymphome angio centrique ProT Thymocyte mature CD8 Lymphocyte T CD8 Lymphocyte NK B mature naïf ProB PréB B immatureThymocyte mature CD4 Lymphocyte T CD4 D’après Dr Bensa EFS Grenoble

10 Cellule pro-B précoce Récepteur IL-7 Kit (CD117) SCF Cellules stromales Progéniteur lymphoïde commun Différenciation du lymphocyte B: Signaux et facteurs de transcription (1) EBF1 RAG PU-1 Ikaros E2a Recombinaison D-J (IGH) PU-1 Ikaros E2a Récepteur IL-7 VLA-4 VCAM-1 Autres CAMs IL-7 Cellules stromales Cellule pro-B tardive IGH Recombinaison V-DJ PU-1 Ikaros E2a EBF1 Pax5 CD19 Récepteur IL-7 Pax5 RAG PU-1 Ikaros E2a EBF1 CD19 Recombinaison V-DJ (IGH) Cellules stromales

11 Différenciation du lymphocyte B: Signaux et facteurs de transcription (2) Pre-B cell IGH Recombinaison V-DJ PU-1 Ikaros E2a EBF1 Pax5 CD19 Récepteur IL-7 Cellules stromales Immature B cell Ikaros E2a EBF1 Pax5 IGH Recombinaison V-DJ PU-1 Ikaros E2a EBF1 Pax5 CD19 Récepteur IL-7 IgM membranaire Cellules stromales Chaîne légère 5 VpreB Ikaros E2a EBF1 Pax5 Ig  /Ig  Recombinaison V-J (IGL) RAG

12 Problème: Il existe 30 000 gènes dans le génome humain et plus de 10 9 Ig différentes CDR1 CDR2 CDR3 V C Protéines FR1 FR2 FR3 V C C C H L ADN V V J JD Rappels: plusieurs régions / plusieurs gènes Immunoglobulines L H

13 VH1VH1VHn-1VHnVHn CC CC C3C3C  C  C  C  JH1 à JH6 CC C  Chromosome 14q32: Chaîne lourde DHDH n=125 (7 familles)n=26 V1V1V  n-2 V  n-1 VnVnJ  1 à J  5CC Kde Chromosome 2p12: Chaîne légère kappa n=76 (6 familles) V 1V n-2 V n-1 V nJ 1 C 1J 2 C 2J 3 C 3C 4C 5J 6 C 6J 7 C 7 Chromosome 22q11: Chaîne légère Lambda n=74 Complexicité des loci et multiplicité des gènes Diversité combinatoire immunoglobulines  HH

14 VH1VH1VHn-1VHnVHn CC CC C3C3C  C  C  JH1 à JH6 Chaîne lourde DHDH VH1VH1VHn-1VHnVHn CC CC C3C3C  C  C  DH-JH 1) Recombinaison somatique D-J VH1VH1 CC CC C3C3C  C  C  VH-DJH 2) Recombinaison somatique V-DJ ADN réarrangé CC VH-DJH ARN prémessager Poly A 5’ Transcription Epissage VDJC Poly A 5’ Traduction Maturation ARN messager Recombinaison – Transcription - Traduction

15 Réarrangements et diversité jonctionnelle = marqueurs de clonalité Insertion de nucléotides Délétion de nucléotides à l’extrémité 3’ du gènes V Marqueur de clonalité Marqueurs de clonalité Délétion de nucléotides à l’extrémité 5’ du gène J Délétion de nucléotides à l’extrémité 3’ du gène D Délétion de nucléotides à l’extrémité 5’ du gène D Gène VL particulier Gène JL particulier J1J1 V3V3 J4J4V  D1D1 Gène VH particulier Gène JH particulier 10 9 to 10 12 clones différents VV JJ Diversité du répertoire Diversité liée: - Recombinaison - Jonction - Association Lymphocyte 1 Lymphocyte 2 Lymphocyte 3 Coupures aléatoires et addition de nucléotides Diversité Jonctionnelle

16 JUNCTION gatt tgtgcgaaa gtggtgactgctat actcctgg 3’V-REGION D-REGION 5’J- REGION agcatattgtg acaactggttcg N-REGION tcc tacc N-REGION ga C A P Y R G D T Y D Y S W tgtgcgccaggggtgactactat tgt gcg cca tac cgg ggt gac act tat gat tac tcc tgg http://imgt.cines.fr Mécanisme de recombinaison Génération de la diversité de séquence – TdT et N-diversité Pr MP. Lefranc Institut de Génétique Humaine, IGH, UPR CNRS 1142

17 Diversité combinatoire – diversité d’association 1- Recombinaisons somatiques Réarrangement intrachromosomique au sein de chacun des loci: IGH, IG , IGL Diversité « Combinatoire » - Multiplicité des gènes -Association aléatoire entre des gènes V-J (et VDJ) Chaîne H : n VH x n DH x n JH Chaîne L : n VL x n JL Diversité « Jonctionnelle » 2- Association des chaînes Diversité « d’Association » - Réarrangement indépendant entre les chaînes - BcR: H et L - TcR:  et  /  et  Chaîne H x Chaîne L - Processus Indépendant de l’Ag - Processus Ordonné 1) Chaîne H : D J puis V D-J 2) Chaîne  :V J

18 IgM transmembranaire IgM sécrétée / IgM membranaire ADN réarrangé LVDJ C1C1C  C  C  MCSC pAs pAm Transcrit primaire ARNm Protéine AAA IgM transmembranaire (C-terminal) Traduction et maturation protéique Clivage au second poly-A et épissage Transcription IgM sécrétée ADN réarrangé LVDJ C1C1C  C  C  MCSC pAs pAm Transcrit primaire ARNm Protéine AAA IgM sécrétée (C-terminal) Traduction et maturation protéique Clivage au second poly-A et épissage Transcription SC: Séquence de sécrétion MC: Exon du domaine transmembranaire pA: Séquence de poly-adénylation

19 CTGAAATC AGTTTTTGA JJ V  CC 12 N 23 N V  V  JP1 JP V  GTGTCACCACAGTG Règle 12/23 d’appariement des RSS: La recombinaison des gènes des Ig/TcR ne se produit qu’entre deux segments géniques possédant des RSS de tailles différentes IGKV IGK (2p11.2) 12-RSS23-RSS IGKJ 23-RSS IGHV IGH (14q32.33) 12-RSS IGHD 12-RSS23-RSS IGHJ 23-RSS TRBV TRB (7q34) 12-RSS TRBD 12-RSS23-RSS TRBJ 23-RSS IGLV IGL (22q11.2) IGLJ 12-RSS 23-RSS TRAV TRA (14q11.2) TRAJ 12-RSS 23-RSS TRGV TRG (7P14) TRGJ 12-RSS 23-RSS TRDV TRD (14q11.2) 12-RSS TRDD 12-RSS23-RSS TRDJ Mécanisme de recombinaison: Séquence signal de recombinaison: RSS (1) IGLVIGLJ heptamer23nonamer CACAGTGACAAAAACC GTGTCACTGTTTTTGG heptamer12nonamer CACTGTGGGTTTTTGT GTGACACCCAAAAACA

20 Mécanismes de recombinaison: Délétion versus Inversion (2) V  JJ CC JP V  JP1 V  CACAGTG-23-CTGAAATC V  AGTTTTTGA-12-CACTGTG J1 1) Recombinaison par délétion V  JP1 JP GTGTCAC-12-AGTTTTTGA CTAAAGTC-23-GTGACAC Cercle d’excision 2 Joint signal J  CC J  V  V  J1J1V  AGTTTTCAG-23-CACTGTG V  TCAAAAGTC-12-GTGACAC J3J3 2) Recombinaison par inversion CACAGTG - CTGAAATC GTGTCAC - AGTTTTTGA JJ V  CC 12 N 23 N V  JP1 JP V  1 RAG1/2 TCAAAAGTC-12-GTGACAC AGTTTTCAG-23-CACTGTG V  J  V  J1J1 J  CC V  1 RAG1/2 JJ CC V  V  Joint codant 3 NHEJ J  CC J  V  V  J1J1V  AGTTTTCAG-23-CACTGTG TCAAAAGTC-12-GTGACAC Séquence inversée Joint codant Joint signal 2 NHEJ

21 Mécanisme de recombinaison (3) Reconnaissance des RSS par le complexe RAG 1) Fixation Patient RAG déficient - SCID B-T - Non radiosensible J Le complexe RAG (RAG1-RAG2) se fixe au séquence RSS (12/23) Cx RAG V 2) Rapprochement spatial J V Les complexes protéiques s’associent et mettent à proximité les ségments à associer 3) Coupure J V L’ADN est clivé pour créer une structure en épingle à cheuveux à chacune des extrémités des gènes

22 Mécanisme de recombinaison (4) Résolution des coupure – Activation de la voie NHEJ NHEJ = non homologous end joining pathway - Voie ubiquitaire de réparation de l’ADN Patient déficient pour un des facteurs - SCID B/T (plus ou moins sévère) - Radiosensible J V Le complexe protéique (Arthemis, cernunos, Ku70/Ku80, Kinases dépendantes de l’ADN) se fixe sur l’ADN et ouvre l’épingle Une exonucléase supprime des nucléotides et génère des extrémités imprécises puis La TdT ajoute des nucléotides de façon aléatoire La DNA ligase IV associée à XRCC4 scelle les extrémités des gènes pour former le joint codant et le joint signal Joint codant Joint signal

23 Ouverture de l’épingle et apparition de séquence palindromique P-Nucléotides Addition de N-Nucléotides pa la TdT Appariement des brins L’exonucléase supprime les nucléotides non appariés Synthèse du brin complémentaire et ligation: Formation du joint codant Mécanisme de recombinaison Génération de la P-diversité P-Nucléotides: Ouverture imprécise de la structure en épingle à cheuveux

24 Chronologie des réarrangements des gènes de Ig et risque vitale pour la cellule B Cellule pro-B précoce Cellule pro-B tardive Réarrangement du locus IGH Réarrangement D-J sur chaque chromosome Réarrangement V-DJ sur le second chromosome I Réarrangement V-DJ sur le premier chromosome Perte de la cellule I Cellule pré-B Réarrangement des loci IGL Réarrangement V-J sur le premier locus  + Cellule B immature CL-  Réarrangement V-J sur le second locus  + I Perte de la cellule I Réarrangement V-J sur le premier locus Réarrangement V-J sur le second locus I I Cellule B immature CL- +

25 Mécanisme d’editing BcR ou Ig membranaire présentant une spécificité vis-à-vis d’un auto- antigène (Ag du soi) Editing des chaînes légères V1V1V  n-2 V  n-1 VnVn J1J1 CC Kde Chaîne légère kappa réarrangée J  J  J  J  V1V1 V  n-2 CC Kde Réarrangement secondaire J  J  J  V  n-1 VnVnJ1J1 J  + Nouvelle chaîne légère Nouvelle spécificité de l’Ig

26 Cellule souche Locus IGH Locus IGL Ig de surface CG Absente Cellule pro-B précoce CG Réarrangement D-J Absente Cellule pro-B tardive CG Réarrangement V-DJ Absente Petite cellule pré-B VDJ Réarrangé Réarrangement V-J Chaîne  intracellulaire Cellule B immature IgM VDJ Réarrangé VJ Réarrangé IgM membranaire Cellule B mature IgM IgD VDJ Réarrangé VJ Réarrangé IgM et IgD Membranaire épissage Réarrangement des gènes des immunoglobuline et développement des cellules B CG VDJ Réarrangé Pré-BCR Grande cellule pré-B Pré-BCR  LC Prolifération

27 VH1VH1 CC CC C3C3C  C  C  VH-DJH ADN réarrangé CC VH-DJH ARN prémessager 5’ Transcription CC Epissage VDJ C  Poly A 5’ ARN messager VDJ C  Poly A 5’ Coexpression par le LB mature d’une IgM et d’une IgD de même spécificité antigénique Traduction - Maturation IgMIgD

28 OL-II aire – dépendantes de l’antigène et des LT MO – Aléatoire - Indépendantes de l’antigène Génération de la diversité Diversité « Combinatoire » - Multiplicité des gènes - Association aléatoire entre des gènes V-J (et VDJ) Diversité « Jonctionnelle » - Au niveau des jonctions V-D-J et V-J, perte et/ou addition de nucléotides (N-diversité) Diversité « d’Association » -Réarrangement indépendant entre les chaînes - BcR: H et L - TcR:  et  /  et  « Hypermutations somatiques » -Mutations ponctuelles au niveau de la région V -Ne concerne que les Ig « Révision » -Réarrangement secondaire VJ (Sur les chaînes légères  et  - Remplacement du ségment V sur le bloc VDJ des chaines lourdeS « Conversion génique » - Copie d’une partie d’un gène V au sein d’une recombinaison VJ formée - Mécanisme de diversification du répertoire chez les oiseaux Mécanisme « d’Editing » -Réarrangement secondaire VJ - principalement sur les chaînes légères (et  )

29 Distribution des organes lymphoïdes – circulation des lymphocytes Moelle osseuse VPC Ganglion Amygdale Plaque de Peyere Peau poumonRateFoie Canal Thoracique SANG Afférents Efférents

30 CDF Th Zone T Zone B Réaction folliculaire – Génération des lymphocytes B effecteurs et mémoire ? ? ? Ig Ag Cellule B HMS Zone sombre Zone claire Centre germinatif Cellule B mémoire Apptose Sélection CI Centroblaste Différenciation Plasmablaste Plasmocyte Centrocyte Cellule B mémoire

31 Hypermutation somatique dépendante de l’antigène Intervention de la polymérase éta (Polymérase à fort taux d’erreures)

32 Commutation isotypique dépendante de l’antigène VDJ CC CC C  C  C  bC  aCC CC SS S  S  S  bS  aSS CC VDJ CC CC C  CC SS S  S  CC C  S  VDJ CC CC C  SS CC CC Expression d’une chaîne lourde  ou  Commutation isotypique VDJ C  CC SS S  CC C  S  VDJ SS CC CC Expression d’une IgG3Expression d’une IgA

33 Mécanisme moléculaire de la Commutation isotypique 2) Création de sites abasiques 1) Déamination des cytosine par AID 3) Clivage au niveau des sites 4) Résolution

34 Manteau Zone claire Zone sombre T fDC B Centrocyte (Ig mutée) - commutation isotypique Centroblaste - Hypermutation somatique Cellule B naïve Maturation folliculaire – Commutation isotypique et hypermutation somatique (Adapté de Liu et Banchereau ) B T Plasmocyte Moelle osseuse Cellule mémoire Circulation

35 Révision du répertoire (chaînes lourdes d’Ig) Repose sur l’existence de RSS cryptique (heptamère) DJVH2VH4 VH3 VH1 RSS cryptique VH2VH4 VH3 VH1 DJ Premier remplacement VH2 VH4 VH3 Second remplacement

36 Conversion génique – Mécanisme de diversification du répertoire chez les oiseaux Un seul V fonctionnel Configuration germinal des locus codant pour les Ig chez le poulet DD VHVH PseudogènesV H C J Pseudogènes V V CC JJ Diversification par conversion génique - Copie d’une partie d’un pseudogène à partir du chromosome homologue C VJ Les séquences des pseudogènes Vsont introduits au sein des réarrangements par gène conversion CC VDJ  Une seule recombinaison possible CC VDJ  Cellules B immatures de poulet: toutes ont réarrangés le même gènes VH C VJ

37 RAG-Low+low+ - IgHGL DJ H V H DJ H ---- IgLGL VLJLVLJL VLJLVLJL V L J L ?- CD34+++/------ CD19-+++++++ CD10--+/-++ -- Cellule souche Cellule Pré-pro-B Cellule Pro-B Cellule Pré-B Précoce Cellule Pré-B tardive Cellule-B immature Calnexine Ig  -Ig  Igµ LL Ig  ou Ig Moelle osseuse Cellule-B transitionnelle Cellule-B mature mIgM mIgD Périphérie Différenciation des lymphocytes B

38 Développement des lymphocytes T 1)Les étapes et les particularité des mécanisme de recombinaison 2)Sélection positive et négative 3)Les sous-population de lymphocytes T CD4+ 4)Les fonctions 5)La mémoire

39 Recombinaison et maturation des thymocytes (1) Configuration germinale des loci ProcessusGénome et réarrangementCellule Thymocyte CD4 - /CD8 - VVJC D VJC V    Thymocyte CD25 + /CD44 low réarrangement des gènes des chaînes  Réarrangement D  -J  (des réarrangements des chaînes  et  peuvent se produire VVJC DJ VJC V    Réarrangement V  -DJ  Production d’une chaîne  Thymocyte CD25 + /CD44 low chaînes  cytoplasmique VDJJC VJC V    chaînes 

40 Recombinaison et maturation des thymocytes (2) ProcessusGénome et réarrangementCellule Expression membranaire de  associée à la pseudo chaîne  Arrêt des réarrangements  Prolifération Induction de CD4 et CD8 VJC DJ VJC V    CD4 - /CD8 - CD4 + /CD8 + pT  /  membranaire CD3 very low  pT  CD8 CD4 CD3 Recombinaison et maturation des thymocytes (1) Réarrangement V  J  Expression à la surface de  CD  Début des séléctions positives et négatives VJC DJ VJC    CD4 + /CD8 +  /  membranaire CD3 low  CD8 CD4 CD3

41 V1V1V  n-2V  n-1VnVnJ  1.1 à J  6C  C  Chromosome 7q34: Chaîne Béta n=64-67 (21-23 familles) V1V1V  n-2V  n-1VnVnà J  71J  CC Chromosome 14q11.2: Chaîne Alpha n=44-46 (34-36 familles) Particularités des loci et possibilité de « sauvetage » TcR  D  J  2.1 à J  6 D  Locus TRD

42 TcR Peptide HLA CPA Antigène LYMPHOCYTE T Sélection positive /sélection négative « Reconnaissance du non soi dans le contexte du soi » Sélection des cellules T reconnaissant les molécules du CMH Délétion des LT ayant une forte avidité pour les complexe CMH- peptides du soi

43 Les différents types de lymphocytes T CD4: différenciation et rôle Clairance des pathogènes intracellulaire IFN-  IL-4 IL-5 IL-13 Resistance aux infections par des parasites Réponses humorales IL-17 IL-21 IL-22 IL-26 Recrutement des G. Neutrophiles (bactéries extracellulaires) TGF-  IL-10 Suppression des réponses immunes Maintien de la tolérance périphérique Réactions allergiques Auto- immunité Auto- immunité - - - Cellules T H 1 Cellules T Reg T CD4+ naifs Cellules T H 2 Cellules T H 17 IL-12 T-bet TGF , IL-2 FOXP3 IL-2, IL4 TSLP, GATA3 TGF , IL-6, IL-21 IL-23, ROR 

44 D’après Nature Reviews Immunology 8, 337-348 (May 2008) APC LT CD4 + naif LT CD4 + activé CD28 ICOS CD4 TCR CMHII APC LT Phase d’activation et différenciation du lymphocytes T CD4 1) Reconnaissance CD4 TCR CMHII APC LT 2) Adhesion CD54=ICAM-1 CD11a/CD18=LFA-1 CD58= LFA-3 CD2 3) Activation CD4 TCR CMHII CD154= CD40L CD40 CD28 CD80= B7.1 ICOS LICOS CD152= CTLA-4 CD86= B7.2 Clairance des pathogènes intracellulaire Cellules T H 1 IFN-  IL-12 Resistance infections par parasites Réponses humorales Cellules T H 2 IL-4 IL-5 IL-13 IL-4 Recrutement des G. Neutrophiles Inflammation Cellules T H 17 IL-17 IL-21 IL-22 IL-26 IL-6