Identification des cellules responsables des effets du récepteur des glucocorticoïdes sur la vulnérabilité à la cocaïne Mutagenèse conditionnelle chez.

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2 Identification des cellules responsables des effets du récepteur des glucocorticoïdes sur la vulnérabilité à la cocaïne Mutagenèse conditionnelle chez la souris Maco 28/05/2006 Bonjour messieurs. Tout d'abors, je voudrai vous remercier les membres du jury d'avoir accepté d'évaluer mon travail de thèse et pour certains de vous être déplacé de si loin. Je vais donc vous présenter les résultats de mon travail de thèse qui a permis d'identifier les cellules qui sont responsables des effets du GR sur la vulnérabilité à la cocaïne. Marc Turiault, UMR7148, Collège de France

3 Réponse au stress et glucocorticoïdes
Rétrocontrôle négatif Modulation des comportements + CRH Hypothalamus Hypophyse ACTH + Glande surrénale Lors de la perception d’un évènement stressant, le système nerveux central intègre l’ensemble des données sensorielles et stimule entre autres certains neurones de l’hypothalamus qui vont alors sécréter au niveau du système porte hypophysaire de la corticolibérine aussi appelée CRH. Cette libération va permettre l’activation de l’axe hypothalamus-hypophyse-glande surrénale. En effet, en réponse au CRH les cellules de l'adénohypophyse vont libérer de l'adrénocorticotropine ou ACTH dans la circulation systémique. Et, au niveau des glandes surrénales, ACTH va induire la libération d'hormones glucocorticoïdes. Ces hormones vont ensuite interagir avec un grand nombre de fonctions physiologique et permettrait ainsi une adaption de l'organisme à la présence du stress. Par exemple les GC stimulent la gluconéogenèse ou la lipolyse ou encore la réponse immunitaire. Mais les GC ont aussi une action sur le système nerveux où ils vont d'une part effectuer un rétrocontrôle négatif entre autres au niveau de l'hypothalamus et d'autre part ils sont capable de moduler certains comportements comme la réponse aux drogues, ou les comportements associés à l’anxiété. Glucocorticoïdes Gluconéogénèse Réponse immunitaire Réparation tissulaire Lipolyse

4 Glucocorticoïdes et psychostimulants
Injection GC/stress :  réponse aux psychostimulants Adrénalectomie :  réponse aux psychostimulants Vulnérabilité accrue aux drogues chez des animaux stressés MR GR De nombreux travaux font état d'une comorbidité chez l'homme entre des pathologies liées au stress et l'addiction. Mais l'établissement d'un lien causal entre stress et addiction n'a pu être démontré que chez l'animal. Ainsi le fait de stresser des animaux favorise l'ensemble des paramètres associés à la consommation de drogues toxicomanogènes tels que l’auto-administration et la rechute. Et l'injection de GC suffit à reproduire les effet du stress sur la réponse aux drogues. De plus, le blocage de la libération des GC par une approche pharmacologique ou par adrénalectomie (suppression de la glande surrénale) à des effets opposés sur la consommation de cocaïne. Ces hormones GC agissent par l'intermédiaire de deux récepteurs nucléaires qui sont également des facteurs de transcription : le MR et le GR. Et des études pharmacologiques ont suggéré que les effets des GC sur la réponse aux drogues passaient plutôt par une activation du GR.

5 Mécanisme d’action du récepteur des glucocorticoïdes
transcription AP1 NFkB Stat5 GRE nGRE Glucocorticoides hsp G R AR MR PI3K Akt Dans le cytoplasme, ce GR se trouve sous forme inactive lié à des protéines chaperones telles que les protéines de choc thermique comme hsp90. La liaison d'une molécule de GC va modifier la conformation du GR qui va alors se trouver sous sa forme active. Cette modification de conformation induit une translocation du GR vers le noyau. Dans le noyau, le GR activé peut alors interagir avec des séquences spécifiques connues que sont les séquences GRE et nGRE. La liaison aux séquences GRE permettant d'activer la transcription d'un gène alors que la liaison aux séquences nGRE induit une inhibition. L'interaction avec ces séquences se fait sous forme d'homodimère ou d'hétérodimère avec les MR et le AR. D'autre part le GR peut interagir avec d'autres facteurs de transcription et agir comme co-activateur de transcription comme c'est le cas avec STAT5 ou comme répresseur de la transcription comme avec AP1 ou NFKB. cette dernière interaction étant responsable du principal effet anti-inflammatoire des GC.

6 Mutation du GR Allèle sauvage Allèle null Pas de protéine produite
Domaine de liaison au ligand Domaine de liaison à l’ADN 1a 1b 1c 2 3 4 5 6 7 8 9 Allèle null Pas de protéine produite Mort des nouveaux nés Afin détudier la fonction de ce gène François Tronche et Christophe Kellendonk on réalisé une mutation supprimant le 3ème exon du gène a été réalisée. Cette mutation induit une suppression du premier doigt de Zinc qui permet la liaison à l'ADN. Et le fait de supprimer cet exon induit également un décalage de la phase ouverte de lecture, ce qui implique une suppression du domaine de liaison au ligand. Chez les souris homozygotes pour l'allèle neul il n'y a en fait aucune protéine produite puisqu'un anticorps dirigé contre la partie N-terminale ne détecte plus la protéine. Ces souris meurent à la naissance d'atélectasie pulmonaire. Il donc évidemment impossible de faire une étude chez les souris adultes.

7 Mutagénèse conditionnelle du GR
Inactivation de GR dans le système nerveux : souris GRNesCre GRloxP loxP Cre hGH polyA Nestine-Cre Cre Région Nestine 5’ Nestine enh II Tronche et al, Nature Genetics, 1999 Comportement Collaboration Pour étudier l'effet de la mutation du GR sur le cerveau adulte, il était donc nécessaire d’effectuer une mutation plus restreinte. François Tronche a alors développé une souris portant une inactivation du GR spécifiquement dans le système nerveux. Ils ont utilisé le système Cre/lox chez la souris qui permet de muter un gène dans un tissu donné de l’animal. Pour cela, ils ont tout d’abord développé une première souris dans laquelle le 3ème exon du gène GR endogène a été flanqué de deux sites loxP. Les souris obtenues sont élevées à l’état homozygote et présentent cet allèle modifié dans toutes les cellules de l’organisme et expriment normalement la protéine GR. Par ailleurs, une deuxième souris a été développée dans laquelle le transgène NesCre a été introduit. Dans ce transgène, la recombinase cre est exprimé sous le contrôle des éléments régulateurs du gène de la nestine et permet à la recombinase de n’être exprimé que dans les cellules du système nerveux. Ces souris sont ensuite croisées avec les souris GRloxP. Dans le cerveau des souris issues ce croisement, la cre est exprimée et va aller recombiner les sites loxP et permettre la délétion du 3ème exon. En revanche dans le reste de l’organisme, la cre n’est pas produite et le GR est donc normalement exprimé. On voit ici chez les souris GRNesCre, un exemple de la disparition du GR dans l’hippocampe alors que dans le foie, l’expression du GR n’est pas modifiée.

8 Etude comportementale de la réponse à la cocaïne des souris GRNesCre
Sensibilisation comportementale après injections chroniques Auto-administration Ces souris ont permis d’étudier la rôle du GR dans la réponse à la cocaïne. 2 tests qui sont considérés comme de bons modèles de dépendance ont été réalisés sur ces souris. Le premier est celui de la sensibilisation comportementale qui met en évidence une augmentation des effets locomoteurs de la drogue lors d’injections répétée de cocaïne. Le deuxième test est celui de l’auto-administration dans lequel les animaux décident eux-mêmes de s’autoadministrer la drogue. Ces tests ont été réalisé sur les souris GRNesCre juste avant mon arrivée au laboratoire.

9 9 injections (intervalle:2 jours)
L’absence de GR dans le cerveau bloque la sensibilisation comportementale 9 injections (intervalle:2 jours) Groupe 3 (chronique) Cocaïne Cocaïne Groupe 2 (aiguë) Saline Cocaïne Groupe 1 (contrôle) Saline Saline 30 jours Test (15mg/kg) (7,5mg/kg) Activité locomotrice 50 100 150 200 250 300 350 Contrôles a * 50 100 150 200 250 300 350 GRNesCre * b saline acute cocaine chronic cocaine Deroche-Gamonet et al, Journal of Neuroscience,2003 Activité locomotrice Véronique Deroche. Dans le premier test, celui de la sensibilisation comportementale, il y a 3 groupes pour chaque génotype (donc mutant et contrôle). Dans le groupe 1, est le groupe contrôle les animaux vont subir des 9 injections de solution saline en 17 jours avec une injection tous les 2 jours. Le jour de l’enregistrement de l’activité locomotrice, après 30 jours de sevrage, les animaux de ce groupe reçoivent à nouveau une injection de solution saline. Pour le groupe 2,, le traitement chronique est le même mais les animaux reçoivent une injection aiguë de cocaïne le jour du test. Et enfin le groupe 3 est celui qui permet de mettre en évidence la sensibilisation comportementale. Durant les 9 injections les animaux sont traités à la cocaïne et le jour du test une dernière injection de cocaïne doit en théorie avoir un effet plus fort sur l ’acitivité locomotrice que l’injection aiguë du groupe 2 qui eux sont naïf pour la cocaïne le jour du test. Chez les souris contrôles, pour le groupe 2 on voit une augmentation de l’activité locomotrice induite par l’injection aiguë de cocaïne comparé au groupe 1 ayant reçu une injection de solution saline. Pour le groupe 3, on voit une sensibilisation due au traitement chronique avec une acté loco encore plus élevée que chez les souris ayant reçu une injection aiguë de cocaïne. Chez les souris GRNesCre, on observe également un effet de l’injection aiguë de cocaïne, EN REVANCHE l’absence de GR dans le cerveau se traduit par une absence de sensibilisation comportementale, on voit que les souris traitées de façon chronique à la cocaïne n’ont pas une activité plus élevées que les souris ayant reçu une injection aiguë.

10 Diminution des propriétés motivationnelles de la cocaïne en absence de GR dans le cerveau
Cage d’auto-administration Days 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Nose-Pokes 15 20 25 30 35 40 45 50 a FR1 FR2 FR3 FR5 Acquisition Trou inactif -GRNesCre Trou actif- GRNesCre Trou actif -GRloxP Trou inactif -GRloxP Deroche-Gamonet et al, Journal of Neuroscience, 2003 Cocaine doses (mg/kg/inj) 0.03 0.06 0.12 0.25 0.5 1.0 2.0 20 40 60 80 100 120 140 b * Dose réponse Nose-Pokes Pour le test d’auto-administration de cocaïne, le souris sont anesthésiées et opérées afin de placer un cathéter dans leur veine jugulaire. Le cathéter permet ensuite d’injecter une drogue dans la circulation systémique des souris. Les animaux sont placés 1h30 par jour dans une cage comme celle-ci. Le cathéter est alors relié à une seringue contenant de la cocaïne. Et une pompe automatisée permet d’injecter de la cocaïne à la souris à chaque fois qu’elle met son museau dans le troup situé sur la paroi droite de la cage. Il y a un troup identique sur la paroi de gauche mais il est inactif. Lorsque la souris met son museau dans un trou, on dit que la souris a fait un nose-poke et c’est ce qui est représenté ici. Dans la première étape d’acquisition du comportement on s’assure que les souris différentient bien le trou actif en noir du trou inactif en blanc. Pendant cette phase on augmente le nombre de nose-pokes nécessaires pour obtenir une injection. Au début il faut faire un nose poke pour une inj° puis 2 nose poke pour une inj°. Les souris augmentent donc le nombre de nose-pokes dans le trou actif pour conserver un nombre d’injection constant. Les carrés sont les mutants et les ronds, les contrôles et l’on voit qu’ils le même comportement au cours de la période d’acquisition. Une dose réponse a ensuite été réalisée en modifiant la concentration de cocaïne présente dans la seringue d’injection. Et l’on voit que les souris contrôles s’adaptent à la diminution de concentration en augmentant le nombre d’injections jusqu’au moment où la concentration devient trop faible et conduit à l’extinction du comportement. Mais chez les souris GRNesCre, les souris abandonnent très rapidement le comportement et ne sont pas prêtent à fournir plus d’efforts pour palier à la diminution de la concentration en cocaïne. Ceci est caractéristique d’une forte diminution de la vulnérabilité des animaux à la cocaïne. L’absence de GR dans le cerveau a donc conduit a diminuer fortement les propriétés motivationnelles de la cocaïne.

11 Quelles cellules sont responsables des effets du GR sur la vulnérabilité à la cocaïne ?
Marc Turiault Frederic Ambroggi Paris Bordeaux L'objectif de mon travail de thèse a été de poursuivre ces investigations et d'identifier les cellules responsables de ces effets du GR sur la vulnérabilité à la cocaïne. L'ensemble de ces travaux à été réalisé en collaboration avec le laboratoire de PV Piazza et plus particulièrement avec Frederic Ambroggi qui a plus travaillé sur le versant électrophysiologique et les marquages rétrogrades alors que je me suis concentré sur la génération et la caractérisation des souris transgéniques et sur l'étude comportementale de la réponse à la cocaïne. Mais l'ensemble des expériences réalisées dans le cadre de cette thèse est vraiment le fruit d'une réflexion commune

12 Quelles cellules sont responsables des effets du GR sur la vulnérabilité à la cocaïne ?
Système méso-cortico-limbique Cortex préfrontal Noyau accumbens ATV Pour identifier les cellules responsables des effets du GR nous nous somme intéressé au système de récompense qui est très impliqué dans la réponse aux drogues et l'axe principal de ce système est le système dit méso-cortico-limbique comprenant les neurones dopaminergiques de l'aire tegmentale ventrale et deux strucutures sur lesquelles projettent les neurones dopaminergiques que sont le noyau acc et le cortex pref. La cocaïne, l'héroïne ou l'alcool par exemple stimulent le système mésocoticolimbique et induisent une augmentation des concentrations en dopamine dans le noyau accumbens et le cortex préfrontal. De nombreuses études ont montré que cette augmentation est au coeur du processus qui conduit au développment de l'addiction. Les GC agissent également sur ce système en augmentant par exemple l'activité dopaminergique. Nous avons donc dans un premier temps voulu voir dans un premier temps si l'inactivation du GR dans le cerveau chez les souris GRNesCre avait un effet sur l'activité dopaminergique, ce qui pourrait expliquer le phénotype comportemental. Nous avons donc enregistré, in vivo, l’activité électrique des neurones dopaminergiques de l’aire tegmentale ventrale chez des souris GRNesCre anesthésiées. Drogues   transmission dopaminergique Glucocorticoïdes   l’activité électrique des neurones dopaminergiques Les neurones dopaminergiques ont-ils une activité différente en absence de GR ?

13 Fréquence d’occurrence des bouffées (Hz)
GR est impliqué dans le contrôle de l’activité des neurones dopaminergiques Contrôles GRNesCre Neurone de l’AVT Amplificateur Ordinateur Audio mon Oscilloscope µ manipulateur 1.8 Hz 2.4 Hz 4.4 Hz 4.6 Hz 1 sec Hz Hz 0,25 L’électrode enregistre les variations locales de potentiel extracellulaire à proximité des neurones. Et elle permet de discriminer les potentiels d’actions. Chez les souris contrôles, la fréquence des potentiels d’action est d’environ 4 Hz et l’on voit que l’absence de GR induit une diminution de la fréquence des potentiels d’action puisque celle-ci passe à environ 2Hz chez les souris GRNesCre (en montrant les traces brutes). C’est ce qui est représenté sur cet histogramme. Nous avons évalué la fréquence d’occurrence des bouffées de potentiels d’action qui est un paramètre physiologique important de l’activité dopaminergique. Et l’on retrouve également un forte diminution de la fréquence d’occurrence des bouffées chez les souris GRNesCre. L’activité dopaminergique est donc fortement diminuée. Ces résultats montrent que le GR est impliqué dans le contrôle de l’activité des neurones dopaminergiques. 4 0,2 3  0,15 2  0,1 1 0,05 Cont GRNesCre Cont 1 GRNesCre Fréquence de décharge (Hz) Fréquence d’occurrence des bouffées (Hz)

14 Quelles cellules sont responsables des effets du GR sur l’activité dopaminergique et la vulnérabilité à la cocaïne ? Cortex préfrontal NO GR ATV Noyau accumbens Ces résultats suggèrent que les neurones dopaminergiques sont la cible de l’action du GR sur le système de récompense. Afin de tester cette hypothèse, nous avons développé des souris transgéniques présentant une inactivation du GR dans les neurones dopaminergiques et étudié chez ces souris la réponse comportementale à la cocaïne et l ’activité dopaminergique. Système méso-cortico-limbique

15 Inactivation du GR dans les neurones dopaminergiques
Gène DAT Cre Homologie 5’ Homologie 3’ BAC DAT 210kb Cre GRloxP loxP Nous avons donc généré une souris transgénique exprimant la recombinase Cre sous le contrôle de l’ensemble des éléments qui régulent l’expression du gène du transporteur de la dopamine. Nous avons utilisé la technique de recombinaison homologue dans la bactérie pour pouvoir insérer la Cre au niveau de l’ATG du gène DAT lui-même contenu dans un très grand fragment d’ADN de 210kb dans un chromosome artificiel de bactérie de 210 kb. Ces souris ont ensuite été croisées avec les souris GR floxées. Chez les souris issues de ce croisement, la Cre n’est exprimée que dans les neurones qui expriment le transporteur de la dopamine et inactive donc le GR de façon spécifique dans les neurones dopaminergiques. GRnull NO GR

16 Recombinaison spécifique des neurones DA
TH Cre X-gal loxP STOP LacZ Souris DATiCre Souris DATiCre – R26R Voici des tranches de mésencéphales de souris DATCre adultes. On voit ici l’expression de la tyrosine hydroxylase, une enzyme qui participe à la synthèse de la dopamine et qui dans cette région du cerveau est spécifiquement exprimée dans les neurones dopaminergiques. La partie centrale ici correspond à l’aire tegmentale ventrale alors que la partie latérale correspond à la substance noire compacte. A droite, il s’agît d’un immunomarquage de la Cre effectué sur une coupe adjacente et permet de voir que l’expression de la Cre suit le profil d’expression de la tyrosine hydroxylase dans l’aire tegmentale ventrale et la SNC. Pour contrôler que la Cre intégrée est fonctionnelle et qu’elle permet une recombinaison selon même profil, nous avons croisé les souris DATCre avec des souris Rosa26. Ces souris il a été intégré une construction dans le locus rosa26 avec une cassette stop flanquée de 2 sites loxP placée devant le gène LacZ. Dans les cellules où la Cre est exprimée, celle-ci va recombiner l’ADN au niveau des sites loxP, induire la délétion de la cassette STOP et ainsi permettre l’expression du gène LacZ. Ce gène code pour la beta-galactosidase qui est une enzyme dont on peut suivre l’activité enzymatique à l’aide de X-gal. Le produit formé bleu permet donc de suivre les cellules dans lesquelles la Cre a induit une recombinaison. A gauche, il s’agît d’un marquage de la tyrosine hydroxylase et à droite, on voit que la recombinaison induite par la Cre chez les souris DATCre-Rosa 26 suit exactement le même profil.

17 Recombinaison dans les neurones dopaminergiques de l’ATV
Souris DATiCre Souris DATiCre – R26R β-Gal DAT Ov iCre TH iCre TH iCre DAT Ensuite nous sommes passés à de l’imagerie confocale pour préciser au niveau cellulaire le profil d’expression de la Cre et le profil de recombinaison Tous ces marquages ont été effectués dans l’aire teg ventr. Ici, nous avons effectué des doubles marquage immunoflurescent de la Cre et de la tyrosine hydroxylase montrant que dans l’aire tegmentale ventrale toutes les cellules positives pour la tyrosine hydroxylase expriment la recombinase Cre. Nous avons également contrôlé que la Cre était exprimée dans les même cellules que le transporteur de la dopamine. Chez les souris DATCre croisées avec les souris rosa26, on voit que la Beta galactosidase en vert est exprimée dans les même cellules que le transporteur de la dopamine en rouge, ce qui confirme que la recombinaison est spécifique des neurones dopaminergiques. Ensuite nous avons croisé les souris DATCre avec les souris GR floxé. Ici, dans l’aire tegmentale ventrale, le GR en rouge est exprimé dans les cellules qui expriment la tyrosine hydroxylase en vert mais également dans d’autres cellules. Chez les souris GRDATCre, le GR n’est plus exprimé dans les cellules positive pour la tyrosine hydroxylase mais est toujours présent dans d’autres cellules. Nous avons donc obtenu une invalidation du GR spécifique des neurones dopaminergiques. GRloxp/loxp GRDAT-Cre Souris GRDATiCre TH GR Ov

18 L’inactivation de GR dans les neurones dopaminergiques n’a aucun effet sur l’autoadministration de cocaine Acquisition Trou inactif- GRDATCre Trou actif- GRDATCre Trou actif -Contrôles Trou inactif -Contrôles Noses pokes Dose réponse GRDATCre Contrôles Injections Cocaïne (mg/kg/inj) Point de rupture Ratio progressif Afin d’étudier l’effet de cette mutation du GR sur la réponse à la cocaïne, nous avons testé chez les souris GRDATCre le comportement d’auto-administration. Mutants et contrôles ne diffèrent pas pour la période d’acquisition et montrent une bonne discrimination des trous actifs et inactifs. La dose réponse a donné un résultat très inattendu puisque les 2 génotypes ne diffèrent pas et se montrent capables de compenser la diminution de la concentration en cocaïne par une augmentation du nombre d’injection. Afin d’approfondir l’étude de la motivation des souris pour la cocaïne nous avons effectué un test de ratio progressif qui est un index de la motivation des animaux pour la cocaïne. Dans ce test on augmente progressivement au cours d’une session d’1h30 le nombre de demande que doit faire la souris pour recevoir une injection de cocaïne. On voit ici que les mutants et contrôles peuvent faire jusqu’à 10 noses pokes en moyenne pour obtenir une injection. Ces résultats montrent que l’inactivation du GR dans les neurones dopaminergiques n’a aucun effet sur la motivation des souris pour la cocaïne.

19 Pas d’effet de l’absence de GR dans les neurones dopaminergiques
? Cortex préfrontal NO GR ATV Noyau accumbens 4.4 Hz, 7% Bursts 4.6 Hz 7% Burst GRloxP GRDATCre Fréquence d’occurrence des bouffées (Hz) Fréquence de décharge (Hz) PARADOXAL. Nous avons ensuite regardé si cette absence d’effet de la mutation du GR sur les effets comportementaux de la cocaïne pouvait s’expliquer au niveau physiologique. Nous avons donc enregistré l’activité dopaminergique que chez les souris GRDATCre. On voit ici que l’absence de GR dans les neurones dopaminergiques n’a aucun effet sur leur fréquence de décharge ou sur la fréquence d’occurrence des bouffées. Le phénotype électrphysiologique est donc cohérent avec le phénotype comportemental de réponse à la cocaïne. Nos résultats montrent donc que le GR exprimé dans les neurones dopaminergiques n’intervient ni dans le contrôle de l’activité dopaminergique ni dans les effets du GR sur la réponse à la cocaïne. Nous avons ensuite émis l’hypothèse d’une action du GR au niveau des cible du système dopaminergique dans les neurones qui expriment le récepteur D1.

20 Inactivation du GR dans les neurones post-dopaminergiques
YAC D1A 140 kb Gene D1 U r a T r p C E N 4 Homologie 5’ Cre Homologie 3’ Cre GRloxP loxP Pour tester cette hypothèse, nous avons utilisé une souris transgénique développée par Thomas Lemberger dans laquelle le gène de la recombinase Cre est exprimé sous le contrôle de l’ensemble des éléments qui régulent l’expression du gène du récepteur D1 à la dopamine. Cette souris utilise aussi un très grand fragment d’ADN de 140 kb contenu dans un chromosome artificiel de levure. Ces souris ont ensuite été croisées avec les souris GR floxées. Chez les souris issues de ce croisement, la Cre n’est exprimée que dans les neurones qui expriment le récepteur D1 et inactive donc le GR de façon spécifique dans les neurones dopaminoceptifs. loxP GRnull NO GR

21 Inactivation du GR dans les structures post-synaptiques du système dopaminergique
Cre striatum n. acc. olf. tub. V et VI GR GRloxP/loxP GRD1Cre Striatum Hippocampe GR VTA TH GR GR - TH On voit ici l’expression de la Cre les structures qui expriment le récepteur D1 telles que la striatum, le noyau accumbens ou les tubercules olfactifs. Chez les souris GRD1Cre, on voit dans le striatum une forte diminution du marquage pour le GR alors que l’expression est inchangée dans l’hippocampe. Un marquage immunofluorescent nous a permis de vérifier que dans l’aire tegmentale ventrale, le GR en rouge est toujours exprimé dans les neurones qui expriment la tyrosine hydroxylase en vert.

22 Forte baisse de la motivation pour la cocaïne en absence de GR dans les neurones dopaminoceptifs
Acquisition Jours Nose-Pokes Trou inactif- GRD1Cre Trou actif -Contrôles Trou inactif -Contrôles Trou actif- GRD1Cre Dose response Injections Cocaïne (mg/kg/inj) GRD1Cre Contrôles Ratio progressif Nous avons étudié l’effet de la mutation dans les neurones dopaminoceptifs sur le comportement de consommation de cocaïne. Au cours de la période d’acquisition, les 2 génotypes discriminent bien le troup actif du trou inactif. En ce qui concerne la dose-réponse, on voit que les mutant abandonnent très rapidement la consommation de cocaïne lorsque les concentrations en cocaïne diminuent. Le test du ratio progressif montrent que les souris GRD1Cre ont une très faible motivation pour la cocaïne quelque soit la dose utilisée, elle ne vont en moyenne pas au-delà de 4 noses pokes pour obtenir une injection. Nous avons donc identifié les cellules responsable des effets du GR sur la motivation pour la cocaïne.

23 9 injections (intervalle:2 jours)
L’absence de GR dans les neurones dopaminoceptifs suffit à bloquer la sensibilisation comportementale Test 30 jours 9 injections (intervalle:2 jours) Groupe 1 (contrôle) Saline Saline Groupe 2 (aiguë) Saline Cocaïne (7,5mg/kg) Groupe 3 (chronique) Cocaïne Cocaïne (15mg/kg) (7,5mg/kg) Contrôles Activité locomotrice GRD1Cre Activité locomotrice Nous avons vérifié si la diminution de motivation enregistrée avec le test d’auto-administration était associée à un effet sur la sensibilisation. Chez les souris contrôles, on observe pour le groupe 3, une sensibilisation due au traitement chronique avec une acté loco plus élevé que chez les souris ayant reçu une injection aiguë. Chez les souris GRD1Cre, on observe également un effet de l’injection aiguë de cocaïne, EN REVANCHE il n’y a pas de sensibilisation comportementale, on voit que les souris traitées de façon chronique à la cocaïne n’ont pas une activité plus élevée que les souris ayant reçu une injection aiguë. La mutation de GR dans les neurones dopaminoceptif suffit donc a bloquer le développement de la sensibilisation comportementale.

24 Corticostéronémie et comportement des souris GRD1Cre
Matin Soir Rythme circadien Contrôles GRD1Cre Réponse au stress Temps (min) Activité locomotrice Jour Nuit Champ ouvert Labyrinthe en croix surélevé Piscine de Morris Jour 1 Jour 2 Jour 3 Coordination motrice Jours Enfin, nous avons réalisé une large étude comportementale ainsi qu’une mesure de la corticostéronémie des souris GRD1Cre. Il existe un rythme circadien de sécrétion des GC avec un pic au début de la période d’activité. Ce premier graphique montre que la mutation du GR dans les neurones dopaminoceptifs ne modifie ni le rythme ni les niveaux de GC circulants. L’augmentation de la sécrétion en réponse à un stress de nouveauté n’est pas modifiée non plus. La rythme circadien de l’activité locomotrice est le même entre mutants et contrôles. Il n’y a pas de différence de coordination motrice dans le test du rotarod ni de différence de mémoire épisodique dans le test de la piscine de Morris. Chez les souris GRNesCre, la faible motivation pour la cocaïne était associée à une diminution des comportements associés à l’anxiété. Chez les souris GRD1Cre, nous avons réalisé le test du labyrinthe en crois surélevé et celui du champ ouvert qui sont 2 paradigmes permettant de mettre en évidence des différences de comportements associés à l’anxiété et ou l’on voit qu’il n’y aucune différence dans les 2 tests. Ces résultats montrent que les comportements associés à l’anxiété et à l’addiction font intervenir le GR dans des types cellulaires différents anatomiquement ces 2 pathologies. . Ces résultats sont importants car chez les souris GRNesCre les niveaux de GC circulants et la réponse au stress sont très altéré ce qui complique profondément l’interprétation des résultats. Ici

25 Fréquence d’occurrence des bouffées (Hz)
L’absence de GR dans les seuls neurones post-dopaminergiques modifier l’activité des neurones dopaminergiques Fréquence de décharge (Hz) GRloxP GRD1Cre 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5  Fréquence d’occurrence des bouffées (Hz) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 3.6 Hz, 20% Bursts Hz, 0% Bursts 1 sec Cortex préfrontal NO GR ATV Noyau accumbens Nous avons également étudié l’activité dopaminergique chez ces souris. Les résultats montrent une diminution de la fréquence de décharge et de la fréquence d’occurrence des bouffées comparable à ce qui a été observé chez les souris GRNesCre en absence de GR dans le cerveau. La mutation du GR dans neurones dopaminoceptif induit donc indirectement une diminution de l’activité dopaminergique qui permet d’expliquer le phénotype comportemental de diminution de la motivation pour la cocaïne.

26 Par quel mécanisme le GR influence l’activité dopaminergique ?
Quelles afférences de l’ATV sont invalidées en GR chez les souris GRD1Cre ? Dans le cortex préfrontal ? Voie directe Dans le noyau accumbens ? Voie indirecte ? Nous avons donc montré que le GR exprimé dans les neurones dopaminoceptifs qui expriment le récepteur D1 intervient dans le contrôle de l’activité dopaminergique et à la vulnérabilité à la cocaïne. Nous avons ensuite tenté d’identifier le mécanisme responsable de ces effets. Dans un premier temps nous avons évalué le niveau de recombinaison du GR pour les principales structures afférentes à l’aire tegmentale ventrale et qui expriment le récepteur D1 donc pour le cortex préfrontal et le noyau accumbens. Cortex préfrontal Noyau accumbens Pallidum ventral ATV ?

27 La majorite des neurones D1 qui projettent à l’ATV expriment le GR
Invalidation dans le cortex préfrontal ? Fluorogold Cre GRD1Cre % FG+/Cre+ 20 40 60 80 100 GRD1Cre Contrôles Fluorogold GR % FG+/GR+ 20 40 60 80 100 ? FluoroGold Cortex préfrontal ATV Noyau accumbens Pallidum ventral

28 La majorité des neurones du NAc qui projettent directement à l’ATV n’expriment plus le GR
Invalidation dans les neurones de la voie directe NAc-ATV ? Fluorogold Cre GRD1Cre % FG+/Cre+ 20 40 60 80 100 GRD1Cre Contrôles % FG+/GR+ Fluorogold GR * 20 40 60 80 100 FluoroGold Nous avons effectué la même expérience mais cette fois en observant l’ immunomarquage Cre et GR dans le noyau accumbens. Le comptage montre ici que plus de 80% des neurones qui projettent à l’aire tegmentale ventrale expriment la Cre et que seulement 20% expriment le GR alors qu’ils sont proche de 100% chez les contrôles. Il apparaît donc que une large majorité de neurones du noyau accumbens qui projettent à l’aire tegmentale ventrale sont invalidés en GR. Cortex préfrontal Noyau accumbens Pallidum ventral ATV ?

29 Les neurones de la voie indirecte NAc-PV-ATV présentent un faible taux d’invalidation du GR
Invalidation dans les neurones de la voie indirecte NAc-PV-ATV ? Fluorogold Cre GRD1Cre % FG+/Cre+ 20 40 60 80 100 GRD1Cre Contrôles Fluorogold GR % FG+/GR+ 20 40 60 80 100 Le contrôle du noyau accumbens sur l’aire tegmentale ventrale se fait par deux grandes voies. L’une est directe et concerne essentiellement des neurones qui expriment le récepteur D1. Nous avons vu que la plupart de ces neurones sont invalidés en GR et l’autre indirecte, passe par le pallidum ventral et concerne des neurones qui expriment plutôt le récepteur D2. Donc en théorie, ces neurones devraient globalement toujours exprimer le GR mais comme la discrimination des populations de neurones qui expriment D1 et D2 est toujours sujet à controverse, nous avons regardé si les neurones de la voie indirecte projetant au pallidum ventral sont invalidé en GR. Pour cela nous avons donc injecté le traceur rétrograde dans le pallidum ventral et fait des immunomarquage Cre et GR dans le noyau accumbens. Les résultats ici montrent que moins de 20% des neurones qui projettent au pallidum ventral expriment la Cre et que plus de 80% expriment le GR. Nos résultats confirment donc la discrimination d’expression des récepteurs D1 et D2 et montrent chez les souris GRD1Cre la principale structure de contrôle de l’activité dopaminergique invalidée en GR est le noyau accumbens. Cortex préfrontal Noyau accumbens Pallidum ventral ATV FluoroGold ?

30 Quel est l’effet de la mutation du GR sur la réactivité au glutamate des neurones épineux du NAc ?
ATV Noyau accumbens -1nA -2nA -4nA -8nA…128 Nous nous sommes donc intéressé aux neurones épineux du noyau accumens Ces neurones sont quiescent chez les souris anesthésiées. Nous avons donc étudié in vivo leur réactivité au glutamate par microiontophorèse. Cette technique utilise une électrode multicanaux qui permet à la fois d"injecter des drogues et d'enregistrer la réponse électrophysiologique. Dans les conditiions de pH que nous avons utilisé, le glutamate est chargé et peut donc être éjecté d'une des électrodes en appliquant un courant. On voit ici un exemple de l'activité induite par des saut de courant et donc par l'éjection de glutamate. On peut donc établir une dose réponse au glutamate en augmentant la valeur du courant d'éjection.

31 L’invalidation du GR induit une hyporéactivité au glutamate dans le NAc
Contrôles GRD1Cre On voit ici la dose réponse obtenue chez les souris contrôles. Chez les souris GRD1Cre, on voit apparaître deux populations distinctes de cellules. Les cellules dites rapides ici caractérisées par une haute fréquence ne sont pas différentes des cellules des souris contrôles, en revanche ces cellules dites lentes correspondent à une nouvelle population de cellules, différentes de celles rencontrées chez les souris contrôles. Ces cellules appartiennent très probablement à la population de cellules mutées et représentent la même proportion de cellules mutées du noyau accumbens. La mutation du GR induit donc une hyporéqctivité au glutamate d’une population de neurones du noyau accumbens. Contrôles GRD1Cre

32 L’invalidation du GR bloque le contrôle du noyau accumbens sur les neurones DA de l’ATV
Kynurénate ATV Noyau accumbens Afin de voir si cette hyporéactivité au glutamate du noyau accumbens induite par l’absence de GR est effectivement responsable de la l’hypodopaminergie, nous avons inactivé le noyau accumbens en y injectant du kynurénate et enregistré l’activité dopaminergique. On voit que chez les souris contrôle le blocage de l’activité du noyau accumbens induit une diminution de la fréquence de décharge des neurones dopaminergiques. En revanche chez les mutants, l’activité déjà basse n’est pas modifiée par l’injection du kynurénate. On retrouve le même type de résultats pour la fréquence d’occurrence des bouffées. L’invalidation du GR bloque le contrôle du noyau accumbens sur les neurones DA de l’ATV. Il semble donc que le GR exprimé dans les neurones de la voie directe du noyau accumbens à l’aire tegmentale ventrale participe au contrôle de l’activité dopaminergique.

33 Conclusion la réponse à la cocaïne
Nous avons identifié les cellules responsable des effets du GR sur Le GR participe au contrôle de la réactivité au glutamate des neurones épineux du NAc la réponse à la cocaïne L’activité dopaminergique Le GR contrôle indirectement l’activité dopaminergique Dissociation cellulaire des effets du GR pour l ’anxiété et l’addiction

34 Perspectives Déterminer les gènes différentiellement exprimés : ARNm, protéines (voies de signalisation…) Etude électrophysiologique pour déterminer le mécanisme impliqué dans l’altération de la réponse au glutamate des neurones épineux du NAc

35 CNRS, Collège de France INSERM, Bordeaux DKFZ, Heidelberg
Sébastien Parnaudeau Aude Milet Dominique Lazar Hélène Cambier JeanـDenis Rouzeau François Tronche INSERM, Bordeaux Frédéric Ambroggi Véronique DerocheـGamonet Pier Vincenzo Piazza DKFZ, Heidelberg Thomas Lemberger Céline Diaz