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Projet de Biologie: Mesure in vitro de la créatinine Molécule de créatinine Source: wikipédia Test papier pH Source: www.teesfrance.com GUILBOT Nils ISMAN.

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1 Projet de Biologie: Mesure in vitro de la créatinine Molécule de créatinine Source: wikipédia Test papier pH Source: GUILBOT Nils ISMAN Julien KONCKI Arielle POMATTO Laurianne POUJOL Julie Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

2 Plan I.Quest ce que la créatinine? II.La détection de la créatinine III.La réaction de Jaffé IV.Test de dépôt sur papier V.Test de dépôt sur microbilles VI.Test sur gel dagarose VII.Bilan, perspective et coût du projet Soutenance projet créatinine - 13/05/20112

3 I. Quest ce que la créatinine? Soutenance projet créatinine - 13/05/20113

4 Quest ce que la créatinine? Soutenance projet créatinine - 13/05/20114

5 Quest ce que la créatinine? Taux constant, hors effort Taux constant, hors effort Dégradation par les reins et évacuation dans lurine Dégradation par les reins et évacuation dans lurine Concentration sanguine faible (30 mg/L) Concentration sanguine faible (30 mg/L) Gamme de valeurs de concentration chez lhomme : Gamme de valeurs de concentration chez lhomme : Soutenance projet créatinine - 13/05/20115

6 II. La détection de la créatinine Soutenance projet créatinine - 13/05/20116

7 Pourquoi vouloir détecter la créatinine? Linsuffisance rénale Linsuffisance rénale 3 millions de personnes touchées 3 millions de personnes touchées La filtration glomérulaire nest plus assurée La filtration glomérulaire nest plus assurée Augmentation de la créatinine sanguine Augmentation de la créatinine sanguine Diminution de la clairance Diminution de la clairance Soutenance projet créatinine - 13/05/20117

8 Comment on la détecte? Où trouve-t-on la créatinine? Où trouve-t-on la créatinine? Sang : méthode actuelle Sang : méthode actuelle Urine : on doit détecter une diminution de la clairance Urine : on doit détecter une diminution de la clairance Salive : méthode la plus simple Salive : méthode la plus simple Actuellement, on mesure la créatinine par voie sanguine Actuellement, on mesure la créatinine par voie sanguine Méthode invasive Méthode invasive Problèmes à long terme Problèmes à long terme Obligation de faire appel au personnel médical Obligation de faire appel au personnel médical Soutenance projet créatinine - 13/05/20118

9 Avantage de détecter la créatinine dans la salive Méthode non invasive Méthode non invasive Aucun problème de contamination Aucun problème de contamination Possibilité de faire le test soi même, à la maison Possibilité de faire le test soi même, à la maison Résultat quasi immédiat Résultat quasi immédiat Soutenance projet créatinine - 13/05/20119

10 Objectifs initiaux Trouver une méthode de mesure de la créatinine Trouver une méthode de mesure de la créatinine Moins invasive Moins invasive Moins contraignante Moins contraignante Moins chère Moins chère Test papier Test papier Soutenance projet créatinine - 13/05/201110

11 III. La réaction de Jaffé Soutenance projet créatinine - 13/05/201111

12 La réaction de Jaffé Simple Simple Avec une cinétique de réaction Avec une cinétique de réaction Mais réaction sensible à différents facteurs (sérum: drogue, glucose ….) Mais réaction sensible à différents facteurs (sérum: drogue, glucose ….) 12Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

13 La Gamme de concentration Nécessité davoir 1/3 créatinine Nécessité davoir 1/3 créatinine 1/3 acide picrique 1/3 soude 1/3 soude Volume puits: 200µL Volume puits: 200µL Cinétique: 15 minutes Cinétique: 15 minutes Extension de la gamme Extension de la gamme 13Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

14 La Gamme de concentration Soutenance projet créatinine - 13/05/201114

15 La Gamme de concentration Décalage de la gamme de concentration Décalage de la gamme de concentration => zone à risque dans la zone de virage de la couleur. => zone à risque dans la zone de virage de la couleur. 15 Soutenance projet créatinine - 13/05/

16 La Gamme de concentration Gamme décalée Gamme décalée Mais écart réduit Mais écart réduit Soutenance projet créatinine - 13/05/201116

17 V. Test de dépôts sur papier Soutenance projet créatinine - 13/05/201117

18 Test de dépôts sur papier Objectifs : Objectifs : Etude du comportement des liquides sur les différents papiers Etude du comportement des liquides sur les différents papiers Détermination dun papier optimal pour la réaction Détermination dun papier optimal pour la réaction Etude de la réaction : visualisation de la couleur Etude de la réaction : visualisation de la couleur Protocole expérimental : Protocole expérimental : Dépôt dune goutte de 10 μL de picrate Dépôt dune goutte de 10 μL de picrate Choix du papier optimal pour la réaction Choix du papier optimal pour la réaction Dépôt dune goutte de 5μL de créatinine à 800 μM Dépôt dune goutte de 5μL de créatinine à 800 μM 18Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

19 Test de dépôts sur papier Dépôt dune goutte de 10μL de picrate : Dépôt dune goutte de 10μL de picrate : Test sur 10 papiers différents : plus ou moins absorbant Test sur 10 papiers différents : plus ou moins absorbant Dépôt sur chaque face des papiers Dépôt sur chaque face des papiers Résultats : Résultats : 19Soutenance projet créatinine - 13/05/2011 Papier blanc épais Calque Papier carton face 1 Papier carton face 2

20 Test de dépôts sur papier Analyse des résultats : Analyse des résultats : Dépôts de couleur différente selon les papiers Dépôts de couleur différente selon les papiers Diffusion différente entre deux papiers différents Diffusion différente entre deux papiers différents Diffusion différente entre les faces dun même papier Diffusion différente entre les faces dun même papier Pénétration plus ou moins lente dans les papiers : immédiatement 30 minutes Pénétration plus ou moins lente dans les papiers : immédiatement 30 minutes Contour plus foncé des gouttes : conséquences sur la réaction? Contour plus foncé des gouttes : conséquences sur la réaction? 20Soutenance projet créatinine - 13/05/2011 Goutte de picrate

21 Test de dépôts sur papier Dépôt dune goutte de 5 μL de créatinine à 800 μM : Dépôt dune goutte de 5 μL de créatinine à 800 μM : Choix des papiers où la goutte de picrate a pénétré rapidement Choix des papiers où la goutte de picrate a pénétré rapidement Résultats : Résultats : Soutenance projet créatinine - 13/05/ Limite picrate Limite créatinine Diffusion des molécules On observe un liseré orangé : Réaction qui se produit ?

22 Test de dépôts sur papier Analyse des résultats : Analyse des résultats : Molécules de picrate chassées par la goutte de créatinine Molécules de picrate chassées par la goutte de créatinine Présence dun liseré orange : la réaction « semble » se produire Présence dun liseré orange : la réaction « semble » se produire MAIS faux positif ? MAIS faux positif ? Soutenance projet créatinine - 13/05/ VS picrate picrate + créatinine Différence aisée pour public non averti ?

23 Test de dépôts sur papier Cependant un espoir : le papier n° 7 Cependant un espoir : le papier n° 7 Papier standard créé par les élèves de Pagora en TP Papier standard créé par les élèves de Pagora en TP Pénétration du liquide dans le volume Pénétration du liquide dans le volume Soutenance projet créatinine - 13/05/ Diffusion homogène dans le papier Goutte de picrate : Couleur jaune Couleur homogène Réaction semble se produire MAIS diffusion des molécules de picrate par la créatinine Méthode pour les fixer sur le papier

24 V. Tests de dépôt sur micro billes Soutenance projet créatinine - 13/05/201124

25 Colonne PD 10 Soutenance projet créatinine - 13/05/ Elimination du tampon par Lavage Saturation de la colonne en picrate microbilles poreuses imbibées de picrate

26 Observation au microscope Soutenance projet créatinine - 13/05/201126

27 Réalisation dune gamme sur billes 50 mg de mélange bille/picrate+15 μlitres de créatinine à différentes concentrations 50 mg de mélange bille/picrate+15 μlitres de créatinine à différentes concentrations Soutenance projet créatinine - 13/05/ Changements de couleur peu discernables entre 0 et 600 μMolaires.

28 Expériences et résultats complémentaires - La réaction ne marche que sur des billes humides - La réaction ne marche que sur des billes humides -La réaction marche que les billes soient mises au frais ou laissées à lair ambiant. - La réaction est limitée dans le temps: les billes redeviennent jaune clair après quelques heures Soutenance projet créatinine - 13/05/201128

29 Combinaison billes papier Soutenance projet créatinine - 13/05/ Sur papier peu diffusif: 50 mg mélange Billes picrate + 15 μlitres de Créatinine Concentration Créatinine (μmolaires)

30 Combinaison billes papier Soutenance projet créatinine - 13/05/ Sur papier diffusif:

31 Une limite: la fixation des billes Soutenance projet créatinine - 13/05/ Scotch : Peu efficace Colle scolaire : empêche la réaction

32 VI. Test sur gel dagarose Soutenance projet créatinine - 13/05/201132

33 Comment empêcher le dessèchement des billes ? Si le billes restent en contact avec lair Assèchement du picrate et absence de réaction après ajout de créatinine Problème de conservation du test Conclusion: nécessité disoler les billes de lair Soutenance projet créatinine - 13/05/201133

34 Effectuer la réaction dans un gel dagarose Agarose 0,5% Puits1 : gel 60μL + picrate en solution 60μL Puits2 : billes (50mg) + gel 60μL Puits3 : mélange homogène billes + gel 60μL Ajout de 30 μL de créatinine après solidification du gel Agarose 0,25% Puits1 : 50μL picrate en solution + 50μL gel + 50μL créatinine Puits2 : 50μL picrate en solution + 50μL gel + 25μL créatinine Stœchiométrie 2/3, picrate 1/3 créatinine 34

35 Résultats Agarose 0,5% Puits1 : la réaction a lieu => coloration orangée Puits2 : billes au fond du puits, présence dune couche de gel en surface => le gel sest-il glissé entre les billes? La créatinine ne semble pas pénétrer le gel Puits3 : pas de coloration, la créatinine ne pénètre pas le gel Agarose 0,25% Puits1 : coloration orangée au bout de 15-30min Puits 2 : idem 35

36 Réalisation dune gamme colorimétrique réalisation dune gamme colorimétrique sur gel dagarose mélangé à 50μL de picrate en solution réalisation dune gamme colorimétrique sur gel dagarose mélangé à 50μL de picrate en solution Ajout de créatinine de 300 à 1000mM Ajout de créatinine de 300 à 1000mM Soutenance projet créatinine - 13/05/201136

37 Test de conservation Réalisation de la même gamme colorimétrique après 48h de repos du mélange gel+picrate Réalisation de la même gamme colorimétrique après 48h de repos du mélange gel+picrate La réaction a lieu mais intensité très faible => différence indiscernable. La réaction a lieu mais intensité très faible => différence indiscernable. Soutenance projet créatinine - 13/05/201137

38 Bilan Lutilisation dun mélange picrate en solution + gel dagarose semble être une solution exploitable. Problématique1: déplacer la gamme pour distinguer les couleurs correspondant à différentes concentrations en créatinine ? Problématique2: problème de conservation du test, inexploitable à moyen terme. 38

39 VII. Bilan, perspectives et coût du projet Soutenance projet créatinine - 13/05/201139

40 Bilan des expériences Réactions sur trois types de support : Réactions sur trois types de support : Soutenance projet créatinine - 13/05/ SupportAvantagesInconvénients PapierPeu couteux Facilité dutilisation Diffusion de picrate lors de lajout de la créatinine Micro billesPseudo réaction en solution Observation de la gamme de couleur Couteux Assèchement des billes si mauvais conditionnement Gel dagarosePeu cher Observation de la gamme de couleur

41 Perspectives du projet A développer : A développer : Fixation du picrate sur le papier : Structure du picrate à étudier Fixation du picrate sur le papier : Structure du picrate à étudier Réaction dans le gel dagarose : Conditionnement du gel pour faciliter le test Réaction dans le gel dagarose : Conditionnement du gel pour faciliter le test Soutenance projet créatinine - 13/05/ Dans des micro-puits Sur une bandelette Gel dagarose + picrate Goutte de salive Gel dagarose + picrate salive Analyse

42 Coût du projet Soutenance projet créatinine - 13/05/201142

43 Merci de votre attention ! Merci de votre attention ! Soutenance projet créatinine - 13/05/201143

44 bibliographie An Enzymic Reaction-Rate Assay for Serum Creatinine with a Centrifugal Analyzer, Patrick K. Jaynes, Ronald D. Feld, and George F. Johnson Enzymic Creatinine Assay: A New Colorimetric Method Based on Hydrogen Peroxide Measurement, Piero Fossati, Lorenzo Prencipe, and Giovanni Bert Kinetic Enzymatic Method for Determining Serum Creatinine, Gerald A. Moss, Richard J. L. Bondar, and Diane M. Buzzelli Direct detection of renal function markers using microchip CE with pulsed electrochemical detection, Carlos D. Garcia and Charles S. Henry Method for the microassay of endogenous creatinine in blood and urine of small murid rodents, S. HEWITT Mechanism of Interference with the Jaffé reaction for Creatinine, Martin H. Kroli, Nell A. Roach, Brent Poe, and Ronald J. EIIn Reaction of Alkaline Sodium Picrate with Creatinine: Kinetics and Mechanism of Formation of the Mono-Creatinine Picric Acid Complex John Vasillades Soutenance projet créatinine - 13/05/201144


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