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UE dHématopoïèse Les antagonistes du récepteur aux hydrocarbures aromatiques (AhR) amplifient laccroissement des cellules hématopoïétiques humaines POULET.

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1 UE dHématopoïèse Les antagonistes du récepteur aux hydrocarbures aromatiques (AhR) amplifient laccroissement des cellules hématopoïétiques humaines POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

2 Hématopoïèse I)Introduction II)Résultats expérimentaux III)Mécanisme daction et voie AhR IV)Conclusion POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

3 Introduction But: améliorer les transplants de cellules souches hématopoïétiques (CSH). Actuellement très utilisés ; mais problème de compatibilité HLA pour les allogreffes. Alternative: sang de cordon, mais souvent nombre dunités/cordon relativement faible (NB: on peut cumuler deux sangs de cordon pour avoir une greffe acceptable) A linstar de linsuline pour les diabétiques, il serait cependant intéressant de pouvoir les produire in vivo, et les synthétiser in fine ex vivo. Problème: trouver un milieu de culture adapté. POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

4 Introduction - rappel Différents types de greffe: -Allogreffe: donneur receveur, mais HLA-compatible -Autogreffe: cellules mises en banque pour être réutilisées par le donneur Provenance des CSHs: Cellules souches de sang périphérique (Cytaphérèse) Sang de cordon Moelle osseuse POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

5 Introduction - cultures Ex-vivo, les cultures « traditionnelles » (sérum libre, thrombopoïétine, Stem Cell Factor, Flt3-Ligand et IL-6), efficientes in vivo, donnent bien une prolifération- différenciation ici, mais durant cette dernière les cellules perdent leurs antigènes spécifiques de surface… (CD34 et CD133) CSH CD34CD133 Une équipe a donc passé au crible plus de molécules susceptibles de proliférer-se différencier tout en conservant les marqueurs cellulaires (cellules CD34+ et CD133+)… Parmi elles, SR-1 semble la plus prometteuse. POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

6 Résultats expérimentaux SR1 Identification Structure A long terme et effet dose Cellules de cordon Réversibilité animaux et effet antiprolifératif Total des cellules nucléées Rôle sur la division Lignées Greffe Organes (répartition) Double greffe POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo Remarque préalable : le DMSO est un simple solvant, utilisé comme témoin.

7 SR1 – identification Expression de CD34 et de CD133 en culture en microscopie confocale Hoechst: colore noyaux. Dans la culture contrôle, les cellules perdent leurs marqueurs SR1 DMSO Dans la culture SR1: Les cellules prolifèrent Les CD34 et 133 persistent POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

8 SR1 - structure Stemregenin – 1 (SR1) Analogue moins puissant Hétérocycle dérivé purique substitué en 2, 6 et 9 POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

9 SR1 J7 J21 => Lefficacité de SR1 est dose-dépendante => Lexpression des protéines perdure A long terme: CD34 + CD133 + x 2,6x 2,3 Effet dose: CD34 + Cell totales x 73x 100 POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

10 SR1 – cellules de cordon Mise en culture de 1000 cellules (souches ou progéniteurs) dérivés du sang de cordon Résultats après 21 jours, en cytométrie en flux Fold = [SR1] 1µM /[DMSO] POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

11 SR1 - réversibilité Après lavage, et remise en culture sans SR1, lexpression de CD34 chute et rejoint celle de DMSO => Leffet de SR1 est réversible SR1 DMSO POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

12 SR1: animaux et dose max Cynomolgus Rhésus Chien 14 jours de culture /!\ Représentation des doses à échelle logarithmique Dose maximale efficace pour [SR1] = 1 µM Effet antiprolifératif si [SR1] > 1 µM Aucun effet sur ¢ murines (souris) Uniquement ¢ humaines, simiennes et canines POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

13 SR1 - TNCs Culture de 1000 cellules CD34+ de sang de cordon, en SR1 (noir) ou contrôle (blanc). Le total de cellules nucléées augmente de façon très importante. POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

14 SR1: division symétrique? SR1 DMSO => Pas de rôle dans la division… Mais très bonne conservation des CD34+!! Utilisation du CFSE, colorant fluorescent marquant les divisions cellulaires SR1 DMSO POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

15 SR1 - lignées Augmentation du nombre de néocolonies (CFUs): -Simple myéloïde => Soit un accroissement des progéniteurs multipotants précoces -Simple érythroïde -Bipotentiel granulocyte/monocyte -Multilignée granulocytaire-érythrocytaire- monocytaire-mégacariocytaire.. avec SR1 seul!! POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

16 SR1: greffe Sang après 8 semainesMoelle osseuse 13 semaines => A partir dun nombre restreint de ¢, la greffe prend de manière précoce et soutenue avec SR1 A Mise en culture de ¢ CD34+ de sang de cordon pendant 3 semainesGreffe de 300 ou ¢ sur souris NOD-SCID (immunodéprimées) POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

17 SR1 – organes La répartition par organe (Moelle osseuse, rate, thymus) est sensiblement équivalente, SR1 ou non. Au dessus: sans SR1 En dessous: avec SR1 POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

18 SR1: double greffe SRC (NOD-SCID Repopulating Cells) : cellules humaines capables de reconstitution hématopoïétique = cellules humaines viables après greffe chez la souris Greffe primaire A AB Greffe secondaire B Les SRC en culture avec SR1 supportent jusquà 7 nouvelles transplantations indépendantes !! Transplantation dune fraction de la culture finale précédente POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

19 SR1: mécanisme daction Confrontation de SR1 et de 61 protéines kinases (effecteurs): aucune activité inhibitrice significative trouvée… => Pas de rôle direct En revanche… POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

20 SR1: mécanisme daction SR1 LGC006 CYP1B1 AHRR En comparant SR1 avec son analogue LGC006, 2 gènes-cibles apparaissent très réprimés par lun et non par lautre. Ces deux gènes sont régulés via un mécanisme de signalisation complexe basé sur AhR… POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

21 AhR Récepteur de nature phosphoprotéique. Possède un domaine PAS + structure hélice/boucle/hélice (sans doigt de zinc), et un domaine riche en glutamine pour se lier à lADN Répresseur compétitif : Protéine AHRR (AHR-repressor) localisé dans le noyau interagissant avec Arnt. Absence de ligand: AHR quiescent dans le cytosol, complexé à 2 HSP90 masquant HBH et PAS Présence de ligands exogènes => phosphorylé par la pkC/Tyr, détache HSPs, forme un hétérodimère avec Arnt (AHR nuclear translocator) => noyau => gènes => domaines XRE (en 5 des cytochromes P450: leurs substrats = ligands de AhR! Ex: TCDD, une dioxine) Théoriquement bon: détoxifie. En pratique: produits de la détoxification à effets cancérigènes… POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

22 L AhR-CYP450 Ligand HSP90 AhR Arnt Gène -> ARN -> protéine cytochrome P450 Bloqué ici si SR1 POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

23 L AhR-AhRR Ligand HSP90 AhR Arnt Gène-ARN-protéine répresseur AHRR AhRR POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

24 SR1 – antagoniste dAhR La luciférase sert de gène rapporteur: Cest une enzyme trouvée chez la luciole, dont lactivité émet de la lumière. En insérant lADN codant pour cette enzyme à côté du gène qui nous intéresse, on en fait un gène rapporteur permettant de quantifier lactivité du gène-cible. Avec SR1, le taux de transcription des gènes-cibles dAhR seffondre!! => Activité antagoniste dAhR par action/gènes cibles SR1 DMSO SR1 na que très peu deffet chez la souris, mais est très efficace pour inhiber chez lHomme Spécificité humaine POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

25 SR1 – inhibition directe Prouver le rôle direct de SR1 sur les récepteurs nucléaires dAhR Le domaine PAS a une phylogénie très particulière: chez les animaux inférieurs, sa seule fonction est la régulation circadienne (cycles jours/nuits). Ce rôle existe encore chez lHomme et peut être mis à profit… On met en présence : -PAL (le ligand à photoaffinité pouvant se fixer sur PAS) -Indirubine, dont la fixation à PAL est connue -SR1 (fixation à démontrer) -LGC006 (lanalogue moins puissant de SR1) La chromatographie, confirmée par la courbe, révèle que contrairement à LGC006, SR1 sest lié à tous les PAL (qui napparaissent plus) de façon équivalente à lindirubine. => Par analogie, SR1 fonctionne bien par fixation directe sur PAS POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

26 Rôle dAhR sur linduction de SR1 Il reste encore à expliquer de quelle façon AhR est lié avec lhématopoïèse. Des cellules de cordon CD34+ ont été infectées avec des lentivirus (rétrovirus) exprimant : -la protéine fluorescente verte GFP (permettant de les voir..) -shRNAs ciblant et inactivant AHR Dans les cellules CD34 + GFP +, shRNA conduit à la diminution de lARNm dAHR et de son expression protéique, et conserve CD34 pendant la culture. = > linactivation dAhR a des effets similaires à SR1 POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

27 AhR KD Mais, les effets de SR1 nécessitent ils linactivation dAhR? Une version dAhR privée (Knock-Down) du domaine de fixation pour le ligand a été créé, baptisée CA-AhR.. SR1 ne réussit plus à inhiber lactivité de la luciférase (qui permettait de contrôler lexpression des gènes cibles), et na plus aucun effet sur les cellules CD34+ de sang de cordon!! => Cela prouve bien quSR1 nécessite une fixation à AhR (en loccurrence celle du ligand), et quil augmente le taux de CD34+ des cellules de cordon. POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

28 Conclusion La présence dAhR a été démontrée dans les cellules hématopoïétiques. Son rôle de facteur de transcription activé par un ligand et induisant des enzymes métabolisant des drogues a pu être ici redémontré Mais AhR est aussi impliqué dans des voies de régulations de lhématopoïèse: -HES1 -c-MYC -C/EBP -PU.1 -β-caténine -CXCR4 -STAT5 Un traitement TCDD (dioxine) des souris donneuses entraîne une diminution de lactivité de reconstitution du pool des cellules Lin- cKit+Sca-1+ (= cellules souches) Reste encore à définir les mécanismes impliqués dans ces processus. POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

29 Conclusion -SR1 augmente le nombre des cellules souches -SR1 et les KD AhR maintiennent lexpression de CD34 -SR1 permet la formation de nouvelles colonies multilignée AHR empêche les cellules souches de prendre en greffe en les empêchant de se différencier. Cependant, il nest pas encore possible dexclure lexistence de mécanismes alternatifs: il faudrait de meilleurs marqueurs spécifiques des cellules souches humaines, ainsi que des études cliniques. POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

30 Ouverture Des études complémentaires à celle-ci avaient été réalisées par la même équipe, essayant soit daméliorer laccroissement des cellules souches (angiopoïétine, gènes HOX, chélateurs du cuivre…), soit leur capacité de « Homing » (Prostaglandine E2, fucosylation…) Cette étude-ci permettra, après avoir exploré le potentiel clinique de SR1, daméliorer le rendement des transplantations et trouver dautres applications des transplantations autologues ou allogéniques. POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo

31 Bibliographie POULET Alexandre MICHEL Nicolas Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo


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