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LES CELLULES SOUCHES HÉMATOPOÏÉTIQUES HUMAINES NORMALES : RÉGULATION ET MÉTHODES DEXPLORATION S. Fichelson, 17 Juin 2004 – 5èmes journées du GFM - Rouen.

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1 LES CELLULES SOUCHES HÉMATOPOÏÉTIQUES HUMAINES NORMALES : RÉGULATION ET MÉTHODES DEXPLORATION S. Fichelson, 17 Juin 2004 – 5èmes journées du GFM - Rouen

2 SOMMAIRE - Définition des cellules souches - Transdifférenciation : polémiques - Ontogénèse - Méthodes dexploration - Régulation - Expansion

3 Les Cellules Souches IntestinPeau Cerveau Tissu Hématopoïétique Muscle EctodermeMésodermeEndoderme Foie TOTIPOTENTES PLURIPOTENTES MULTIPOTENTES PROGÉNITEURS ¢ MATURES

4 « TRANSDIFFÉRENCIATION » DES CELLULES SOUCHES Nombreuses études in vivo et in vitro chez la souris Transdifférenciation = phénomène rare + contexte de régénération post-lésionnelle Mise en évidence du phénomène de transdifférenciation ( ):

5 Controverses sur le concept de transdifférenciation Fusion cellulaire ? Reprogrammation ? Homing ectopique? Populations hétérogènes de ¢ souches ?

6 Single hematopoietic stem cells generate skeletal muscle through myeloid intermediates FD Camargo, R Green, Y Capetenaki, KA Jackson & MA Goodel. Nat Med Dec 2003, 9:

7 Semaines de gestation Début de la circulation sanguine Colonisation du Foie par les précurseurs CD Sac Vitellin Hématopoïèse Intravasculaire (aorte, artère vitelline) Foie Thymus Moelle Osseuse Ontogénèse de lhématopoïèse chez lhomme

8 Fibroblastes Myofibroblastes Cytokines Macrophages Protéoglycannes Adipocytes Chimiokines CSH Endothélium Matrice Extra-Cellulaire (Fibronectines, laminines, collagènes, TSP) La « niche » hématopoïétique

9 Représentation schématique des différents compartiments du système hématopoïétique

10 Caractéristiques fonctionnelles Caractéristiques phénotypiques MÉTHODES DEXPLORATION DES CSH

11 DifférenciationMaturationDifférenciation MARQUEURS IMMUNULOGIQUES MARQUEURS FONCTIONNELS CSH CD34 + ou - CD38 - Lin - Thy-1 - Quiescente Résistante au 5-FU Rhod 123 faible Progéniteur Immature CD34 + CD38 - Lin - Thy-1 + Quiescente Résistante au 5-FU Rhod 123 faible Progéniteur Mature CD34 + CD38 + Lin ± Thy-1 ± En cycle Sensible au 5-FU Rhod 123 fort Précurseur Différencié CD34 - CD38 + Lin + Thy-1 - En cycle Sensible au 5-FU Rhod 123 fort I- Caractéristiques phénotypiques des cellules hématopoïétiques humaines

12 Séquence dexpression des marqueurs Cellules MaturesPrécurseursProgéniteurs Lignée Myéloïde Lignée Lymphoïde Megacaryocyte/Plaquettes Monocyte Erythrocyte Eosinophile Granulocyte Cellules souches CD34 HLA-DR, CD38… Ag lin (CD13, CD41, GpA, CD71, CD61…)

13 II - Tests fonctionnels pour létude de lhématopoïèse CSH humaines ? CSH SRC Cultures à long terme Progéniteurs LTC-IC My, Ly Tests clonogéniques CFC Cellules en cours de maturation Caractéristiques phénotypiques

14 1- Tests in vivo de transplantation xénogénique SCID-RC (SRC) mois NOD-SCID Irradiation sub-létale (+ anti-CD122) sem 2 sem En pratique : identification des cellules souches humaines Milieu semi-solide + cytokines 2- Tests in vitro de culture LTC-IC Milieu + sérum + stroma CFC

15 Fréquence des progéniteurs hématopoïétiques humains dans le sang de cordon ombilical ¢ mononucléées ¢ CD34+CD38- SRC 1 / 5x / 600 LTC-IC 1 / 2x / 20 CFC CFC 1 / / 3 Progéniteurs présents au sein des

16 REGULATION DES CSH Auto-renouvellement Détermination Différenciation Facteurs extrinsèques Facteurs intrinsèques et / ou

17 Représentation schématique du rôle des facteurs de transcription hématopoïétiques aux différents stades de la différenciation HoxB4 Bmi1 C/EBP

18 Représentation schématique des principales étapes cibles des facteurs extrinsèques Shh Wnt Jagged/Delta

19 Comment expandre les CSH ? X X Quiescence Auto-renouvellement Différenciation Apoptose Délai Inhibition Stimulation Mise en cycle

20 Approches expérimentales pour lexpansion des CSH humaines - CYTOKINES : FLT3-L + TPO + SCF (Kobari et al; Piacibello et al) ± IL-6 + sIL-6R (Ueda et al) - AUTRES FACTEURS SOLUBLES: Shh (via BMP4) (Bhardwaj et al) FGF-1 (de Haan et al) Wnt-5A (Murdoch et al) ; Wnt-3A (Willert et al) - CELLULES FEEDER (co-cultures + cellules stromales) : (Connealy et al; Miller & Eaves;.... Dexter) - FACTEURS DE TRANSCRIPTION : Homéoprotéines : HOXB4 (HOXC4, B3, A9, A10,...), bHLH : Tal-1/SCL, polycomb : Bmi-1,...

21 Voie Wnt/ Catenine/GSK3 dans les cellules souches (Dishevelled) (Glycogen synthase kinase-3) 6-bromoindirubin-3-oxime (BIO) X Différenciation Auto-renouvellement

22 HOXB4 Contrôle Progéniteurs clonogéniques d 12 CFU-SCellules matures CRU Sauvageau et al., 1995 Effets de sa surexpression sur lhématopoïèse murine HOXB4 :

23 Les homéoprotéines agissent sous forme de complexes transcriptionnels MEIS1 PBX1 Coopération Paralogues Hox HOXPBX1 TGAT NNAT Fixation à l'ADN (Chang et al 1996; Shen et al 1997) HoxB4 + Knock-down de PBX1 CSH « ultra-compétitives » (x 20 par rapport aux cellules surexprimant HoxB4 seul) (J. Krosl et al, 2003)

24 Effets de HoxB4 dans les CSH humaines (Buske et al. Blood, août 2002; Schiedlmeier et al. Blood, mars 2003) Expression ectopique par transduction rétrovirale (= expression constitutive du transgène) àAugmentation du nombre des cellules greffant dans les souris NOD-SCID (SRC) et des CRU (x 3-4)

25 Comment expandre les CSH humaines Sans utiliser de cytokines exogènes * perte de potentiel (?) Sans transfert de gènes * mutagenèse insertionnelle * leucémogénène à long terme ? * dérégulation de lhématopoïèse terminale ? Transduction de la protéine HOXB4

26 Propriété des homéodomaines Transport intercellulaire atypique : sécrétion spontanée et internalisation indépendante de récepteur (formation de micelles inverses) La 3ème hélice de lhoméodomaine : - permet la liaison à lADN - nécessaire et suffisante pour linternalisation de la protéine

27 Résumé de notre travail La PROTEINE HOXB4 est capable de pénétrer passivement dans des cellules hématopoïétiques Ce système permet une expansion des cellules hématopoïétiques humaines primitives, sans manipulation de leur génome, par passage passif (et réversible) de la protéine Nouvelle approche pour des protocoles dexpansion ex vivo des CSH humaines Dans un système de co-culture de CSH humaines avec des cellules stromales sécrétant HOXB4 Amsellem et al, Nat Med, nov 2003


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