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DESC Réanimation Médicale Inter-Régions Rhône-Alpes et Sud-Est Mardi 9 juin 2009 Mécanismes de résistance aux antibiotiques de Pseudomonas aeruginosa Gérald.

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1 DESC Réanimation Médicale Inter-Régions Rhône-Alpes et Sud-Est Mardi 9 juin 2009 Mécanismes de résistance aux antibiotiques de Pseudomonas aeruginosa Gérald AUBERT CHU Saint-Etienne

2 2 Pseudomonas aeruginosa 1 – Mécanismes de résistance aux antibiotiques Rappels et nouveautés 2 – 2 – Activité des antibiotiques sur P. aeruginosa Etude des phénotypes 3 – Cas particulier de la Mucoviscidose Production de biofilm 4 - Impact dun schéma thérapeutique Sélection de souches résistantes 5 – Comment éviter la sélection de mutants résistants Notion de PK/PD

3 3 1 – Résistance aux antibiotiques Origine : naturelle et/ou acquise

4 Origine naturelle Constitutive - intrinsèque : résistance commune à toutes les souches dune même espèce Phénotype sauvage ex: Membrane externe des bacilles Gram négatif (LPS) empêche la pénétration des antibiotiques lipophiles (acide fusidique) et des antibiotiques de masse moléculaire élevée ne pouvant emprunter la voie des porines (pénicilline G, V et M - glycopeptides) La perméabilité membranaire de P. aeruginosa est de 10 à 100 fois inférieure à celle dE. coli

5 Origine acquise Résistance propre à certaines souches ayant par rapport à lespèce à laquelle elle appartient un comportement différent vis à vis des antibiotiques. Cest le résultat de modifications génétiques : * Mutations affectant des gènes naturellement présents sur le chromosome bactérien * Acquisition de gènes étrangers provenant dautres espèces ou portés par des éléments mobiles (plasmides ou transposons)

6 6 Chromosome (AmpC) Plasmide (BLSE) Transposon présent soit sur le chromosome, soit sur un plasmide Bactérie Gènes « sauteurs » Transfert RS horizontal Transfert RS vertical

7 – Mécanismes de résistance Bactéries à Gram positif Bactéries à Gram négatif Inactivation de lantibiotique + Inactivation de lantibiotique +++ Modification de la cible ++ Modification de la cible + Efflux + Imperméabilité ++

8 8 Mécanismes de résistance - Inactivation de lantibiotique Cest un mécanisme fréquent. Il sagit dune destruction de lantibiotique. Ex : Hydrolyse des ß-lactamines par les ß-lactamases - Modification de la cible Généralement on observe soit une modification partielle de la cible, soit une modification du nombre de PLP Ex : modification des PLP chez le pneumocoque induisant une résistance aux ß-lactamines

9 9 - Diminution de la perméabilité La baisse de perméabilité entraîne une diminution de la quantité dantibiotique atteignant la cible. * Protection de la cible Augmentation de lépaisseur de la paroi (remodelage du peptidoglycane) Ex : Staphylococcus aureus de type GISA (résistance partielle aux glycopeptides) * Fermeture des porines Concerne surtout les bactéries à Gram négatif Ex : résistance à limipénème par fermeture de la porine D2 chez Pseudomonas aeruginosa

10 10 Exemple de modification de la perméabilité Porine D2 (OprD): seule voie de pénétration de limipénème chez P. aeruginosa

11 11 - Efflux actif Les systèmes defflux sont constitués de protéines particulières permettant lexpulsion de molécules (nocives) dont les antibiotiques dès quils entrent dans la cellule bactérienne. Activation de lefflux : diminution de la quantité dantibiotique atteignant la cible. Les modifications de la perméabilité membranaire et lefflux actif peuvent concerner des antibiotiques très variés (quinolones, tétracyclines, ß-lactamines...) et sont souvent impliqués dans la multirésistance. Chez P. aeruginosa : 12 systèmes defflux actifs dont 2 impliqués dans la résistance naturelle ( MexAB-OprM ou MexXY-OprM).

12 12 Résistance par diminution de laccumulation intrabactérienne Rejet à lextérieur des antibiotiques : système de pompe M. plasmique M. externe H+ OprM MexA MexB mexAmexB oprM mexR -Résistance: surexpression MexAB-OprM ou MexXY-OprM production MexEF-OprN ou MexCD-OprJ Mex : Multiple Efflux Energie : hydrolyse de lATP, gradient électrochimique de membrane Protéine assurant la liaison entre les 2 membranes Canal protéique Pompe à efflux

13 13 Conséquences de la surexpression des pompes à efflux chez P. aerugionsa ß-lactaminesTicarcillineAztréonam céfépime, cefpirome FQTétracyclinesAminosides MexA-B- OprM Constitutif MexX-Y- OprM Constitutif MexC-D- OprJ MexE-F- OprN

14 14 2 – Activité des antibiotiques sur Pseudomoas aeruginosa Etude des phénotypes de résistance Technique de lantibiogramme (S/I/R) et/ou de la CMI (mg/L)

15 15 Diffusion en gélose bioMérieux bioMérieux Antibiogramme Technique Vitek 2

16 16 Pseudomonas aeruginosa Résistance naturelle aux antibiotiques (imperméabilité membranaire) Pénicilline G et amoxicilline Pénicilline G et amoxicilline Amoxicilline + acide clavulanique Amoxicilline + acide clavulanique C1G et C2G (Cefalotine, Cefoxitine, ….) C1G et C2G (Cefalotine, Cefoxitine, ….) Cefotaxime, ceftriaxone Cefotaxime, ceftriaxone Tétracycline Tétracycline Quinolone 1 ère génération Quinolone 1 ère génération Triméthoprime Triméthoprime Nouveaux ATB inactifs : Tigécycline TigécyclineErtapénèmeMoxifloxacine Daptomycine, Linézolide, … Nouvel ATB actif : doripéneme

17 17 Pseudomonas aeruginosa Mécanismes de résistance aux ß-lactamines Résistance naturelle : une céphalosporinase chromosomique ampC une céphalosporinase chromosomique ampC non inhibée par lacide clavulanique une perméabilité limitée en raison du faible nombre de porines : vitesse de pénétration diminuée par rapport aux entérobactéries (10 à 100 fois moins) une perméabilité limitée en raison du faible nombre de porines : vitesse de pénétration diminuée par rapport aux entérobactéries (10 à 100 fois moins) des systèmes defflux de bas niveau (MexAB-OprM et MexXY-OprM) des systèmes defflux de bas niveau (MexAB-OprM et MexXY-OprM)

18 18 Antibiogramme de P. aeruginosa : phénotype de base Ticarcilline :S Pipéracilline :S Ticar + Ac clav :S Pipé + tazo :S Aztréonam : S Ceftazidime :S Céfépime :S Imipénème :S Méropénème :S Doripénème :S Tobramycine : S Amikacine : S Ciprofloxacine : S ColistineS

19 19 Phénotypes de Pseudomonas aeruginosa Phénotype Phénotype 2007 (CHU St-Etienne) Phénotype Phénotype 2007 (CHU St-Etienne) sauvage sauvage TicarcillineSI/R39 % Ticarcilline + ac. Clav.SI/R39 % Pénicillinases + Pipéracilline + tazo.SI/R19 %céphalosporinase CeftazidimeSI/R18 %haut niveau (ampC) ImipénèmeSR9 % imperméabilité (oprD) AmikacineSR20 % TobramycineSR11 % enzymes : AAC, APH … CiprofloxacineSR20 % mutation gyr A, parC, … ColistineSR0 %

20 20 Pseudomonas aeruginosa Mécanismes de résistance aux ß-lactamines Résistance acquise : - enzymatique: - céphalosporinase hyperproduite (AmpC) - ß-lactamases à spectre étroit :pénicillinase (PSE/CARB, TEM-1 et TEM-2), oxacillinases ; - ß-lactamases à spectre étroit : pénicillinase (PSE/CARB, TEM-1 et TEM-2), oxacillinases ; - ß-lactamases à spectre étendu (BLSE) : - classe A : VEB-1, PER-1, GES-1, TEM-4 …, SHV-5 … - classe B : imipénémase * (metallo ß-lactamases) : IMP, VIM … * (metallo ß-lactamases) : IMP, VIM … * (sérine ß-lactamases) : KPC * (sérine ß-lactamases) : KPC - classe D : OXA

21 21 Pseudomonas aeruginosa Mécanismes de résistance aux ß-lactamines Résistance acquise : - non enzymatique : - imperméabilité : porines Oprf et OprD2 - surexpression de lefflux membranaire : MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN et MexXY-OprM - modification PLP

22 22 Antibiogramme de P. aeruginosa : phénotype résistant aux carbapénèmes Ticarcilline :S Pipéracilline :S Ticar + ac. clav :S Pipé + tazo :S Aztréonam : S Ceftazidime :S Céfépime :S Imipénème :R Méropénème :I/R Tobramycine : S Amikacine : S Ciprofloxacine : S ColistineS Imperméabilité (perte porine OprD2) et surexpression efflux MexEF-OprN ou MexAB-OprM (méropénème) Limipénème nest pas soumis au système defflux Limipénème nest pas soumis au système defflux. Carbapénémase = métallo-enzyme IMP, VIM-1, VIM-2

23 23 Antibiogramme de P. aeruginosa : résistance par phénomène defflux membranaire Ticarcilline :I Pipéracilline :S Ticar + ac. clav :I Pipé + tazo :S Aztréonam : I Ceftazidime :S Céfépime :S Imipénème :S Tobramycine : S Amikacine : S/I Ciprofloxacine : I/R ColistineS Surexpression pompes à efflux : MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN et MexXY-OprM

24 24 Antibiogramme de P. aeruginosa : résistance de type céphalosporinase + ….. Ticarcilline :R Pipéracilline :R Ticar + ac. clav :R Pipé + tazo :I Aztréonam : R Ceftazidime :I/R Céfépime :I Imipénème :S Tobramycine : S Amikacine : S Ciprofloxacine : S ColistineS Hyperproduction de la céphalosporinase AmpC et éventuellement surexpression des pompe à efflux et/ou BLSE : VEB-1, PER, GES-1, TEM, SHV, OXA Hyperproduction de la céphalosporinase AmpC et éventuellement surexpression des pompe à efflux et/ou BLSE : VEB-1, PER, GES-1, TEM, SHV, OXA …

25 25 Pseudomonas aeruginosa Mécanismes de résistance aux ß-lactamines Mécanisme de résistance TicPipCazFepAtmIMI AbsenceSSSSSS PénicillinaseRR/ISI/SI/SS EffluxI/RS/IS/IIIS Céphalospori nase hyper R/IR/II/RI/RI/RS Déficit en porine D2 SSSSSR BLSERI/RRRI/RS ImipénémaseRIRRII/R Tic : ticarcillline, Pip : pipéracilline, Caz : ceftazidime, Fep : céfépime, Atm : aztréonam, IMI : imipénème

26 26 Pseudomonas aeruginosa Mécanismes de résistance aux aminosides Deux mécanismes de résistance acquise (plasmide) : - enzymes inactivant les aminosides (nucléotidylation, phosphorylation ou acétylation). Résistance haut niveau. - diminution de laccumulation de lantibiotique dans la cellule par mutation du système de transport des aminosides. Résistance de bas niveau. Antibiotiques les plus actifs : amikacine et tobramycine

27 27 Infection pulmonaire : cause de mortalité de la mucoviscidose 3 – Cas particulier de la mucoviscidose Le gène responsable de la maladie est localisé sur le chromosome 7au niveau du locus « CFTR ». Une mutation du gène provoque un mauvais fonctionnement de la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Ce disfonctionnement affecte l'ensemble des glandes exocrines de l'organisme ainsi que des fonctions d'excrétion d'eau dans les épithéliums spécialisés. Le gène responsable de la maladie est localisé sur le chromosome 7au niveau du locus « CFTR ». Une mutation du gène provoque un mauvais fonctionnement de la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Ce disfonctionnement affecte l'ensemble des glandes exocrines de l'organisme ainsi que des fonctions d'excrétion d'eau dans les épithéliums spécialisés.. Présence de sécrétions visqueuses et peu hydratées.

28 28 Infection à P. aeruginosa dans le cas de la MUCUVISCIDOSE : formation du biofilm Schémas et photos (prises en microscopie électronique) des différentes étapes de la formation du biofilm – Camille Mace Le biofilm se définit comme une population bactérienne qui adhère à une surface et senrobe dune matrice dexopolysaccharide (Alginate)

29 29 Cette photo prise au microscope électronique montre des bactéries regroupées (en biofilm) sur de la laine de verre. – Sébatien Vilain

30 30 Comportement de P. aeruginosa dans le cas de la MUCUVISCIDOSE Apparition de résistances et de facteurs de virulence lors de situations particulières in vivo : - présence de biofilm (exopolysacharide fabriqué lors de condition danaérobiose qui apparaît dans le la couche profonde du mucus) - hyper –expression des systèmes defflux - activation du quorum-sensing en phase stationnaire et en phase danaérobie Jeune biofilm de Pseudomonoas aeuginosa prise au microscope électronique à balayage © CNRS, Unité "Polymères, biopolymères, membranes"

31 31 Procédures dadaptation chez P. aeruginosa Mucoviscidose et … Régulation par Quorum Sensing (QS) : processus de communication intercellulaire basé sur de petites molécules signal (langage) qui permet aux bactéries de répondre aux changements de lenvironnement (phase stationnaire et anaérobiose) et de synchroniser de manière collective lexpression globale de multiples gènes (las et rhl). Le QS contrôle la synthèse de facteurs de virulence : - interviennent dans lattachement bactérien et la colonisation (paroi): pili de type IV, flagelle … - interviennent dans lattachement bactérien et la colonisation (paroi): pili de type IV, flagelle … - sécrétés hors de la bactéries et provoquant des lésions cellulaires: exotoxine A, élastase, exoenzyme S, pyocyanine, pyocheline … - sécrétés hors de la bactéries et provoquant des lésions cellulaires: exotoxine A, élastase, exoenzyme S, pyocyanine, pyocheline …

32 32 On estime que 6 à 10 % du génome de P. aeruginosa est régulé par le QS Les modèles expérimentaux (souris) et des souches mutantes confirment le rôle des facteurs de virulence et du QS dans la pathogénicité Les macrolides modulent la production dexopolysacharides et de lactivité du QS Avenir thérapeutique : inhibition du QS pour diminuer la pathogénicité de P. aeruginosa S. Bleves et A. Lazdunski – Communication intercellulaire chez les bactéries – Qorum sensing. Bull. Soc. Microbiol., 2007, 22 : Le Berre et al. Quorum sensing : une nouvelle cible thérapeutiquye pour Pseudomonas aeruginosa. Med Mal Infect. 2006, 36 : 349 – 357.

33 33 Traitement des infections à P. aeruginosa MUCUVISCIDOSE En anaérobiose : diminution de lactivité de tous les ATB En présence de biofilm + anaérobiose : aérosol Colistine - tobramycine Méropénème + tobra ou ciproflo Hill D., Rose B., Pajkos A. et coll. – Antibiotic susceptibilities of Pseudomonas aerugionsa isolates …… J. Clin. Microbiol., 2005, 43 : 5085 – 5090.

34 34 Pseudomonas aeruginosa Multi - résistance aux antibiotiques (totorésistance) Ticarcilline :R Pipéracilline :R Ticar + ac. clav :R Pipé + tazo :R Aztréonam : R Ceftazidime :R Céfépime :R Imipénème :R MéropénèmeR Tobramycine : R Amikacine : R Ciprofloxacine : R ColistineS/I Faire des CMI pour définir les niveaux de résistance … Etudier la rifampicine, la fosfomycine, …

35 Impact dun schéma thérapeutique Lexposition à limipénème (ou méropénème) et aux fluoroquinolones (ciprofloxacine) constitue un risque significatif pour lémergence de souches résistantes (mutations ponctuelles). Situation : inoculum important UFC/mL Mais aussi : tazocilline et ceftazidime pour la résistance aux ß-lactamines K. Jennot et P. Plésiat – Implications thérapeutiques de la résistance aux antibiotiques chez Pseudomonas aerugionsa. La Lettre de lInfectiologue. 2005, XX, n°6, C. Pena et col – Carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa: factors influencing multi-resistant acquisition in non-critically ill patients. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2009, 28:

36 36 CMI : 10 5 UFC/mL CMI de la FQ pour la population CPM = CMI : CFU/mL CMI de la FQ pour le mutant de premier niveau Mutant chromosomique résistant de premier niveau (gyrA) CMI = 0,023 mg/L CMI = 0,25 mg/L Ex : E. coli

37 37 CMI : 10 5 UFC/mL CMI : 10 5 UFC/mL CMI de la FQ pour la population CPM = CMI : CFU/mL CMI de la FQ pour le mutant de deuxième niveau Mutant chromosomique résistant de deuxième niveau (gyrA + parC) CMI = 1,5 mg/L CMI = 0,25 mg/L Ex : E. coli

38 38 Quelques principes thérapeutiques … Eviter les antibiotiques peu actifs : céfotaxime, ceftriaxone, gentamicine, netilmicine, ofloxacine … Ne jamais prescrire en monothérapie : fosfomycine, fluoroquinolones, carbapénème … Faire une vraie antibiothérapie au niveau du site infectieux : - ß-lactamine + aminoside - ß-lactamine + ciprofloxacine Tenir compte du PK/PD des antibiotiques

39 39 5 – Comment éviter en clinique la sélection de mutants résistants Notion de PK/PD

40 40 Paramètres de pharmacodynamie Concentration d'antibiotique Temps CMI Q.I.= C max CMI Cmax Temps au dessus de la CMI Temps Cmax ATB temps dépendant : ß-lactamines ATB dose dépendant : aminosides - fluoroquinolones Concentration d'antibiotique

41 41 Notion de PK/PD Fluoroquinolones et aminosides (ATB dose dépendant) : Cmax/CMI = QI > 8 ß-lactamines (ATB temps dépendant) : T > CMI (50 % du temps entre 2 injections 4 à 5 CMI) Glyopeptides (ATB dose et temps dépendant) : C/CMI = 8 et AUC/CMI 400 A. P. MacGowan. Clinical implications of antimicrobial resistance for therapy. J. Antimicrob. Chemother. 2008, 62, Sup 2, ii105 – ii114.

42 42 Variation du PK/PD Paramètres : dose de lATB, volume de distribution (VD), clearence (Cl), liaison aux protéines, la variation de labsorption, la valeur de la CMI. VD VD ÚCl ÚCMI Risque déchec

43 43 - CMI approchée de lantibiotique Technique de lantibiogramme - Référence : la concentration critique basse - CMI réelle de lantibiotique Technique E-Test (10 5 UFC/mL) Une souche de P. aerugionosa est sensible à la ceftazidime pour une CMI de 0,5 à 8 mg/L - CMI de lantibiotique pour le mutant de premier niveau (FQ) présent dans linoculum (CPM) Technique avec UFC/mL Une souche d E. coli sensible à la ciprofloxacine avec CMI = 0,75 mg/L a un CPM = 6 mg/L Une souche bactérienne est considérée comme sensible à un antibiotique - Quelle CMI est à prendre en compte ?

44 Ex : E. coli

45 45 CPM de la rifampicine et de la ciprofloxacine pour S. aureus Temps CMI 9,5 CPM 4 0, ,3 6 Concentration sérique de la ciprofloxacine (mg/L) Temps Fenêtre de sélection des mutants RIFAMPICINE C IPROFLOXACINE Zhao X. and Drlica K. - J.I.D. 2002, 185 : B A Concentration sérique de la rifampicine (mg/L) Fenêtre de sélection des mutants

46 46 CONCLUSION Pseudomonas aeruginosa Espèce peu sensible aux antibiotiques Fréquence importante de mutants résistants (10 -7 ) Transfert conjugatif important des gènes et intégration sur le chromosome Attention : - aux inoculums importants (présence de mutants R) - aux posologies basses (sélection de mutants R) - bithérapies (volumes de distribution des antibiotiques)


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