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Clonage Moléculaire. Définitions Clonage : Clonage : Obtenir un morceau dADN à partir de la source originale (Génome) et lintroduire dans un vecteur dADN.

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1 Clonage Moléculaire

2 Définitions Clonage : Clonage : Obtenir un morceau dADN à partir de la source originale (Génome) et lintroduire dans un vecteur dADN Obtenir un morceau dADN à partir de la source originale (Génome) et lintroduire dans un vecteur dADN Sous-clonage: Sous-clonage: Transfère dune insertion dADN cloné ou une partie de ce dernier dun vecteur à un autre vecteur Transfère dune insertion dADN cloné ou une partie de ce dernier dun vecteur à un autre vecteur Plasmide recombinant: Plasmide recombinant: Vecteur dans lequel un ADN étranger a été introduit Vecteur dans lequel un ADN étranger a été introduit Organisme recombinant Organisme recombinant Organisme dans lequel un vecteur recombinant a été introduit Organisme dans lequel un vecteur recombinant a été introduit

3 3 Pourquoi cloner? Séparer, identifier, manipuler ou exprimer un fragment spécifique dADN Séparer, identifier, manipuler ou exprimer un fragment spécifique dADN

4 Étape 1- Séparer Deux approches: Deux approches: Fragmenter/digérer lADN génomique Fragmenter/digérer lADN génomique Génère un très grand nombre de fragments Génère un très grand nombre de fragments Peut-être difficile de retrouver le fragment dintérêt Peut-être difficile de retrouver le fragment dintérêt Amplification par PCR Amplification par PCR Beaucoup moins de fragments Beaucoup moins de fragments Beaucoup plus facile de retrouver la séquence dintérêt Beaucoup plus facile de retrouver la séquence dintérêt

5 1 plasmide/1 cellule Enzyme de restriction Enzyme de restriction Transformation Cellules Hôte Fragment dintérêt Vecteur approprié Générer des extrémités compatibles Ligature dADN Ligature Intermoléculaire Recombinant Ligature Intramoléculaire Non-Recombinant Cloner Cellule RecombinanteCellule Non-Recombinante

6 1 colonie= 1 clone avec 1 plasmide + 1 insert Duplication de plasmide Croissance bactérienne Amplification des Plasmides Recombinants

7 Criblage et Identification de Clones Recombinants Plasmidiques Cartographie de restriction Cartographie de restriction Hybridation Hybridation PCR PCR

8 Expression Pourquoi? Pourquoi? Produire la protéine dans un système hétérologue Produire la protéine dans un système hétérologue Produire la protéine en grande quantité Produire la protéine en grande quantité Purifier la protéine Purifier la protéine Étudier lactivité de la protéine Étudier lactivité de la protéine

9 Amplification, Mutagenèse, Clonage & Expression de LacZ– Projet II Partie I Partie I Amplification & mutagenèse par PCR du gène LacZ Amplification & mutagenèse par PCR du gène LacZ Partie II Partie II Clonage de LacZ dans pUC19 Clonage de LacZ dans pUC19 Partie III Partie III Esai enzymatique des protéines recombinantes Esai enzymatique des protéines recombinantes

10 Purification & Digestion de l Amplicon Mel 1 Purification par QiaQuick Purification par QiaQuick Permet de retirer le tampon, sels, etc. Permet de retirer le tampon, sels, etc. Permet de retirer les amorces Permet de retirer les amorces Permet de retirer lenzyme Permet de retirer lenzyme Digestion Digestion Sites de restriction BamHI et EcoRI ont été ajoutés à la séquence de lamplicon Sites de restriction BamHI et EcoRI ont été ajoutés à la séquence de lamplicon Absent dans la séquence de Mel 1 Absent dans la séquence de Mel 1 Présent dans le site de clonage multiple du vecteur dexpression (pRS424) Présent dans le site de clonage multiple du vecteur dexpression (pRS424) Permet le clonage dirigé Permet le clonage dirigé


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