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Hyperhomocysteinémie Homocystinurie maladie métabolique maladie conjonctive.

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1 Hyperhomocysteinémie Homocystinurie maladie métabolique maladie conjonctive

2 Erreur innée Macromolécule conjonctive Erreur innée Métabolisme Remodelage tissulaire synthèse dégradation

3 8080 µmol/L Hyperhomocystéinémies modéréesévère homocystinurie Asymptomatique Facteur de risque vasculaire Symptomatologie sévère Complications intermédiaire hyperhomocystéinémie 100

4 Etiologies Hyperhomocystéinémies Déficits enzymatiques 5,10-methylene THF MTHFR Hcy Met SAM SAH cystathionine Cys CBS Ser Hser THF 5-Me THF X Me-X MS Ser Gly B6B6 B 12 B6B6 proteines

5 Etiologies Déficit en CBS Homozygote: très sévère B6-sensible B6-résistant Hétérozygote: modérée, discrète Déficit en MTHFR Homozygote: sévère Hétérozygote: modérée Déficit méthylation B12 intermédiaire Hyperhomocystéinémies Déficits enzymatiques 5,10-methylene THF MTHFR Hcy Met SAM SAH cystathionine Cys CBS Ser Hser THF 5-Me THF X Me-X MS Ser Gly B6B6 B 12 B6B6 proteines X X X

6 Etiologies Hyperhomocystéinémies Déficits vitaminiques Folates, B6, B12, Insuffisance Rénale Chronique Facteurs iatrogènes - Antifoliques Méthotrexate, anticonvulsivants, Sulfasalazine - Anti B6Isoniazide, Procarbazine, Cyclosérine, Azauridine - Inhibiteur MS protoxyde dazote - Oestroprogestatifs Excès dapport en méthionine ?

7 Modèles animaux Hyperhomocystéinémies CBS -/-survie limitée +/-avec régime riche en Met MTHFR +/- Modèles génétiques Modèles diététiques Régimes riches en Met poulet pendant la croissance rat adulte porc adulte

8 Symptomatologie Homocystinurie Lésions oculaires Ectopie du cristallin : inférieure Myopie Luxation du cristallin Diagnostic différentiel Maladie de Marfan : ectopie supérieure ou externe

9 Lésions squelettiques et musculaires Aspect marfanoïde Taille élevée Extrémités longues et fines Arachnodactylie Genu valgum Déformation du sternum Ostéoporose Scoliose Hypotonie musculaire Symptomatologie Homocystinurie

10 Lésions vasculaires Artériosclérose Athérothrombose Atteintes neurologiques Retard mental Autres Lésions cutanées, peau fine, pores élargies Dépigmentation Pneumothorax Symptomatologie Homocystinurie

11 maladie métabolique maladie conjonctive Remodelages de la paroi artérielle Clinique Histologique ? Biochimique ?

12 Homocystinurie – Remodelage matriciel Histological examination showed spectacular alteration of elastic structure in arteries from homocystinuric human « …extracellular matrix deposition, elastica degeneration, smooth muscle cell hyperplasia, and fibrosis. » (Gibson. 1964). « The arteriosclerotic plaques occuring in homocystinuria, whether caused by CBS deficiency, methyl transferase deficiency, or MTHFR deficiency, are typical fibrous plaques, characterized by smooth muscle cell hyperplasia, deposition of extracellular matrix and collagen, and degeneration and destruction of elastic fibers. » (McCully, 1983)

13 Porcs adultes Hyperhomocysteinemie Coronaire Orcein stained 6 µm transverse section Controle hyperhomocysteinemie (x 2) Atherosclerose Evènement précoce (4 mois) majeur (~50 %) Régime riche en Met Hyperhomocystéinémie modérée – Dégradation des structures élastiques artérielles

14 Défaut des structures élastiques artérielles - conséquences tissulaires Souris KO elastine (-/-) proliferation et migration SMCs formation neointima stenose (DY. Li, 2002) IEL renal artery Vue en face, confocal Microscopy Younganimal Oldanimal Fenestration SMCs migration Hyperhomocysteinemie proliferation SMCs Épaississement intimal

15 Défaut dassemblage Dégradation des structures élastiques ? Lhyperhomocysteinemie induit une dégradation majeure des structures élastiques qui peut accélérer le développement de lathérosclérose

16 Composant amorphe: élastine microfibrilles fibrilline-1, -2 MAGP fibuline-1, -2 Fibre élastique Structures elastiques

17 Fibrillines In vivo : embryon de poulet Fib sans défaut des structures élastiques (Boot. 2004) poulet en croissance : Fib défaut structures élastiques (Hill. 2002) In vitro : Fib-1 : défaut de repliement domaines EGF (2005) Fib-1 : dysfonction ( calcium binding, Hubmacher. 2005) Proteoglycans aggregation perturbation interactions (McCully. 1993) Synthèse et réticulation élastine : observations contradictoires Fibres élastiques anormales Hyperhomocysteinemie et élastogenèse

18 Porcs + régime riche en Met : fenestration des lames élastiques contenu en élastine aorte abdominale et coronaire (Charpiot. 1998) Souris ApoE -/- mice + régime riche en Met (Hoffman. 2001) elastolyse dans aorte Degradation structures élastiques artérielles In vivo, animal adulte Rats + régime riche en Met (Zulli. 1995) disparition des lames élastiques aorteHyperhomocysteinemie – dégradation des structures élastiques

19 Hyperhomocysteinemia induces a major degradation of the elastic structure in full grown arteries Proteolytic breakdown ?

20 Porc + régime riche en Met Elastin content (Vv, %) 12 ControlHyperhcy * CH 10 µM100 µMHcy 50 µm µM Hcy * 72 h Hyperhomocysteinemie modérée 4 mois In vivo Ex vivo Culture dexplants artériels + Hcy Aorte abdominale Processus Elastolytique Aorte abdominale

21 * 0 40 Specific elastolytic activity (AU / mg protein) 10100µM Hcy + Phe * CHCH +Phe +Phe (phenanthroline) Inhibiteur de metalloproteinases Processus Elastolytique Porc + régime riche en Met 72 h Hyperhomocysteinemie modérée 4 mois In vivo Ex vivo Culture dexplants artériels + Hcy Aorte abdominale

22 Elastin content (Vv, %) µM100 µMHcy µM Hcy * 100 µM + GM GM6001 GM6001, inhibiteur large spectre des MMPs previent la degradation structurale induite par Hcy Processus Elastolytique MMP-dépendant

23 MMP-9 MMP-2 Gelatin-zymographie 72 kDa - 68 kDa - 92 kDa - TIMPs 26 kDa - 22 kDa - TIMP-1 TIMP-2 Reverse zymographie - 92 kDa - 72 kDa - 68 kDa Western Blot Specific activity (AU / mg protein) µM Hcy Balance MMP/TIMP µM Hcy µM Hcy µM Hcy MMP-2 et MMP-9 élastolytiques Inhibiteurs tissulaires inchangés

24 In vivo, the degradation of the arterial elastic structures induced by hyperhomocysteinemia is more marked in the inner part of the media. - In vivo in human(Mc Cully. 1983) «...disruption of the elastic laminae, usually more marked toward the innermost elastic membrane,… » - In vivo in animal(Charpiot. 1998) Haemodynamic strains ? Endothelium ?Hyperhomocysteinemie – dégradation des structures élastiques

25 10 µM100 µMHcy 50 µm 6 µm transverse section. (+) catechine- stained elastic structure Ex vivo, explants arteriels en culture + homocysteine ½ mediaHyperhomocysteinemie – dégradation des structures élastiques

26 Hyperhomocysteinemia induces a major degradation of the elastic structure in full grown arteries… Localization ? … mediated by MMPs/TIMPs imbalance in favour of elastinolytic MMP-2 and MMP- 9

27 MMP -2MMP-9 10 µ M100 µ M10 µ M100 µ M Hcy 6 µ m transverse sections expression MMP-2 et MMP-9 dans la partie interne de la m é dia … MMPs – Expression tissulaire ½ mediaHyperhomocysteinemie – dégradation des structures élastiques Immunohistochimie

28 10 µ M100 µ M10 µ M100 µ M Hcy TIMPs – Expression tissulaireHyperhomocysteinemie – dégradation des structures élastiques TIMP -1TIMP-2 expression et distributionTIMP-1 et TIMP-2 inchang é es 6 µ m transverse sections Immunohistochimie

29 contribution of endothelium ? …mediated by MMPs/TIMPs imbalance, in favour of elastinolytic MMP-2 and MMP-9,… …more marked in the inner part of the media, even ex vivo Hyperhomocysteinemia induces a major degradation of the elastic structure in full grown arteries…

30 Gelatin Zymography 72 kDa - MMP-2 * * * * * * kDa - Activity (%) (µM) MMP-9 (Lamy. 2004) Potentiel protéolytique des cellules endothéliales (µM) (µM) (µM)

31 -Casein Zymography µM Homocysteine kDa - (1) Absence dinhibiteur (2) Inhibiteur des métalloprotéases (1,10 phenanthroline) (3) Inhibiteur des serine protéases (PMSF) (4) Inhibiteur des cystéine protéases (Iodoacetamide) (5) Inhibiteur des aspartate protéases (Pepstatine A) kDa kDa - 27 kDa Western Blot µM Homocysteine 250 Caseinolytic serine protease Human tissue Kallikrein (hK1) Potentiel protéolytique des cellules endothéliales

32 Hyperhomocysteinemie Problème métabolique Activation de systèmes protéolytiques - déséquilibre MMPs/TIMPs : MMP-2, MMP-9 - serine protease(s?) activatrice de MMPs Dégradation des structures élastiques artérielles Artériosclérose, athérosclérose métabolisme remodelage clinique

33 Hyperhomocysteinemie induit une dégradation majeure induces a major elastic structure degradation, facilitating the development of atherosclerosis,… …mediated by MMPs/TIMPs imbalance, in favour of elastinolytic MMP-2 and MMP- 9,… …more marked in the inner part of the media. Endothelial cells may participate through - elastinolytic MMPs : MMP-2 and MMP-9 - MMPs activating serine proteases : hK1

34 Atteinte structures élastiques artère, cristallin (?), peau (?) Elastolyse vs défaut délastogenèse dans: - hyperhomocysteinemies acquises - hyperhomocysteinemies innées défaut dassemblage des fibres élastiques sensibilité à la dégradation protéolytique ? expression/activité des MMPs ? Et les collagènes ? os, artère, peau (?) Hyperhomocystéinémie Remodelage matriciel

35 Laboratoire de Physiopathologie des Tissus non Min é ralis é s Facult é de Chirurgie Dentaire – Universit é Ren é Descartes – Montrouge Laboratoire de Biochimie UMRs-608. Faculté de Pharmacie – Université de la Méditerranée. Marseille. Thierry Augier André Barlatier Alexandrine Bertaud Raymond Calaf Claire Cerini Corinne Chareyre Edouard Lamy Cécile Genovesio Philippe Charpiot Gaston Godeau Sylvie Igondjo-Tchen Karim Senni


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