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Protéomique d’interaction. Plusieurs technologies : Système double hybride Copurification de protéines Séparation directe des complexes.

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1 Protéomique d’interaction

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3 Plusieurs technologies : Système double hybride Copurification de protéines Séparation directe des complexes

4 La protéine GAL4 est constituée de deux domaines : un domaine N-terminal qui lie spécifiquement une séquence d'ADN (UASG pour upstream activated sequence for the yeast Gal genes). un domaine C-terminal contenant une région acide. Les charges négatives participent à l'activation transcriptionnelle. Quand le facteur de transcription GAL4 se lie, il active la transcription du gène reporter. La protéine GAL4

5 Le gène reporteur. Le gène reporteur le plus utilisé est le gène lacZ, qui code pour une enzyme, la  -galactosidase. L'expression de lacZ peut-être mesurée par un colorimètre, selon le test de l'  complémentation des levures basée sur l'activité de la  -galactosidase.

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7 NOM Copurification de protéines

8 DETECTION PURIFICATIONPROTEINE APPÂT ETIQUETTE 6His

9 Site de coupure pour la protease du TEV Tobacco Etch Virus GFP S65T Biais de codon optimisé pour la levure

10 FRET Protease du TEV Longueur d’onde (nm) Intensité de fluorescence (unités arbitraires) A D Y A D Y X FRET X Expression non toxique dans la levure Transfert d’énergie de fluorescence par résonance

11 6His Calmodulin binding peptideSite de coupure pour la protease du TEV Tobacco Etch Virus GFP S65T Biais de codon optimisé pour la levure

12 Obtention d’une souche exprimant la protéine de fusion Phase de diagnostic Phase de purification Phase d’identification

13 Fragment PCR Vecteur digéré cotransformation Recombinaison homologue stricte Rq : les « accidents » de PCR (non sens et frameshift) sont contrôlés par la fluorescence Obtention d’une souche exprimant la protéine de fusion

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15 Chromatographie en gel d’exclusion Préparation d’un extrait protéique Comparaison entre le poids moléculaire calculé et mesuré Obtention d’une souche exprimant la protéine de fusion Phase de diagnostic

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17 6His x

18 En KDa

19 Chromatographie d’affinité 1 Chromatographie d’affinité 2 Obtention d’une souche exprimant la protéine de fusion Phase de diagnostic Phase de purification HiTrap Chelating chargée en Ni Calmodulin Binding Peptide Sepharose (TEV protease)

20 Phase de purification Phase d’identification Séparation des éléments du complexe par électrophorèse Digestion des bandes polypeptidiques par une protéase Analyse des digestions au spectromètre de masse Obtention d’une souche exprimant la protéine de fusion Phase de diagnostic

21 PDC6 PTC1 PRB1 POR1 THI2 YLR352W SKP1 CDC53 TAG GFP ADE4 ADE4 TAG Protéine inconnue d’Arabidopsis thaliana Protéines de levure

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23 8 partenaires4 10 partenaires2 11 partenaires1 12 partenaires1 7 partenaires5 6 partenaires1 5 partenaires3 4 partenaires5 3 partenaires6 2 partenaires15 hétérodimère1 tétramère1 homodimère2 Pas de complexe54 Observations Nombre d’ORFs 100 ORFs 53%

24 GENESCOMPLEXES MAK10 MAK3 MAK 3, MAK10, MAK 31 MAK31 pas de complexe mis en évidence STO1 STO1, YKL214C, SNU56, SRO9, BUR2, YDL175C, PRP40, PRP42,HTA1, MSH4, NAB3 MUD13 pas de complexe mis en évidence TCP1 pas de complexe mis en évidence TFC1 pas de complexe mis en évidence ADE4 ADE4 (tétramères) RVS167 RVS161, YPL249C RGD1 pas de complexe mis en évidence YNL300W pas de complexe mis en évidence YER007C-A TFA1, ASC1, YER007C-A YKR046C pas de complexe mis en évidence YCR102C pas de complexe mis en évidence YFR044C pas de complexe mis en évidence YFR006W dimères YGL099W pas de complexe mis en évidence YGR245C pas de complexe mis en évidence YDL148C pas de complexe mis en évidence YNL132W pas de complexe mis en évidence + MAK31 Cellzome 11 protéines / 34 protéines Cellzome Avantage GFP 7 protéines Cellzome 26 protéines MDS Proteomics

25 GENESCOMPLEXES RPN9 pas de complexe mis en évidence PYC1 hétérodimère avec PYC2 TKL1 homodimères MIP1 pas de complexe mis en évidence PDA1 TIF2, PFK2, PFK1, LAT1 ENO1 SSC1, ENO1 LPD1 TKL1 PFK1 PFK1, PFK2 TPI1 homodimères TRP1 pas de complexe mis en évidence SUR2 pas de complexe mis en évidence SUP35 SUP35, ROM2, SUP45, TAO3, YJL017W, MRPL23, CLU1, ECM29, NAB3 CDC34 pas de complexe mis en évidence CDC4 SKP1 CDC53 PDC6, PTC1, PRB1, THI21, YBR280C, SKP1 GRR1 pas de complexe mis en évidence HRT1 pas de complexe mis en évidence KEX2 pas de complexe mis en évidence MET30 MET31, HRT1, MET4, CDC53 SGT2 pas de complexe mis en évidence PDC6, PTC1, PRB1, POR1, YLR352W, THI21, YBR280C, SKP1, PDC5 MDS Proteomics

26 GENESCOMPLEXES SKP1 YDR131C, CDC4, SGT1, PRB1, UFO1, CDC53, BOP2 RAD1 pas de complexe mis en évidence RAD10 TIF2, RNR2, CPH1, ARC1, FUM1, SOD2 RAD14 CTF4, RAD16, RAD4 RAD16 HTB2, RAD7, SHP1, TDH3, VPS1,PDC1, PEP4 RAD17 pas de complexe mis en évidence RAD18 pas de complexe mis en évidence RAD2 PEX15 RAD23 pas de complexe mis en évidence RAD24 YLR413W, TCP1, DUN1,RFC3, RPT3, RFC5, YJR072C RAD26 pas de complexe mis en évidence RAD27 POL30 RAD28 TCP1, CCT6, DUN1 RAD3 pas de complexe mis en évidence RAD30 GPH1 RAD4 pas de complexe mis en évidence RAD5 pas de complexe mis en évidence RAD50 SEC27, MRE11 RAD51 MLH1, CLU1, GCN20, GFA1, YHB1,RAD51 RAD52 ALD5 YDR131C, CDC4, SGT1, PRB1, UFO1, CDC53, BOP2 MDS Proteomics

27 GENESCOMPLEXES RAD53 SWI4, ASF1,YMR135C, SMC3, TBF1, SRP1 RAD54 MGE1 RAD55 PTC3 RAD57 pas de complexe mis en évidence RAD59 SEC27 RAD6 UBA1 RAD7 pas de complexe mis en évidence RAD9 DUN1 BDF2 BDF1 CBK1 pas de complexe mis en évidence CDC15 TFP1, AUT2 DUN1 HOM2, SOD1, ADH4, CPH1, PDX3 ESR1 pas de complexe mis en évidence FZF1 pas de complexe mis en évidence GDI1 pas de complexe mis en évidence GUT1 pas de complexe mis en évidence IRA2 pas de complexe mis en évidence MLH1 YOR155C, MGE1, SGS1, HDA1, MGM101, RFA2,, TOP3, VAS1, RNH1 MSH2 RSC8,LCD1, MSH6, PLO1, PLO2, RNH1, MSH6 SGS1, MEC1, RSC8,PLO1, PLO2, TOP3, VAS1

28 GENESCOMPLEXES NCR1 pas de complexe mis en évidence PMA1 pas de complexe mis en évidence SCH9 pas de complexe mis en évidence SET1 BRE2 SGS1 pas de complexe mis en évidence SOD1 pas de complexe mis en évidence SSL1 TFB3, TFB4, SPT7 CCL1, SSL1, CDC95, MRPS28, KAP95, TFA1, TFB1 SSL2 STI1 TEL1 YPL110C YDL085W pas de complexe mis en évidence YMR145C pas de complexe mis en évidence YPK1 pas de complexe mis en évidence BAS1 pas de complexe mis en évidence GRF10 pas de complexe mis en évidence YOR155C pas de complexe mis en évidence BOI1 pas de complexe mis en évidence BOI2 pas de complexe mis en évidence SRA1 pas de complexe mis en évidence CYR1 PHO81, ACT1, SRV2 LAS17 RPN12, END3, YCR030C, SLA2, VMA1, VRP1, SLA1

29 Au moins 5 méthodes de copurification: Système TAP Tag (Cellzome) Système Flag Tag (MDS Proteomics) Système CHH Tag (CSHL) Système GFP TAP Tag (Bordeaux) Système HisMyc Tag (John Yates) Appât-CBP-TEVtarget-ZZ Appât-flag tag Appât-CBP-6His-3Ha Appât-GFP-CBP-TEVtarget-6His Appât-His8-TEV target-Myc9

30 Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Ho et al 10 janvier 2002 Fonctional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Gavin et al L’addition systématique d’une étiquette à une protéine appât constitue une limite pour les approches globales interactions protéine-protéine (299) Cellzome MDS Proteomics

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32 Séparation directe des complexes Séparation par chromatographie bidimensionnelle des complexes protéiques stabilisés par un agent pontant Purification et identification des peptides impliqués dans les complexes protéiques

33 Après la lyse des cellules les protéines sont récupérées

34 Puis les complexes protéiques sont stabilisés en utilisant un agent pontant (dithiosuccinimidylpropionate)

35 DSP (mM) Solubilisation sans mercaptoéthanol

36 Les complexes protéiques stabilisés sont séparés selon leur charge en utilisant un Rotofor

37 20 – = 37 fractions Ampholines pH 3,5-10 Sans Ampholines

38 Chaque fractions issues du Rotofor sont séparées selon la taille par chromatographie d’exclusion (Superdex200) 37 chromatographies 1850 fractions

39 Charge Masse MALDI - TOF  -Mercaptoethanol Trypsine MALDI - TOF Données LC/MS/MS Données

40 Séparation directe des complexes Séparation par chromatographie bidimensionnelle des complexes protéiques stabilisés par un agent pontant Purification et identification des peptides impliqués dans les complexes protéiques

41 Après la lyse des cellules les protéines sont récupérées

42 Biotine Groupes réactifs capables de se fixer aux –NH2

43 Biotine Groupes réactifs capables de se fixer aux –NH2 Congrès ASMS 2001 Michelle Trester-Zedlitz et al Faisabilité sur un complexe

44 Biotine Groupes réactifs capables de se fixer aux –NH2

45 Protéolyse spécifique des protéines

46 Purification par affinité des peptides (avidine sépharose)

47 Identification des peptides associés Même protéine Protéines différentes Analyse par spectrométrie de masse (LC/MS/MS)

48 3 méthodologies : Copurification de protéines étiquetées (proposé en service et en développement Helicobacter pilori) Séparation des complexes stabilisés par chromatographie liquide bidimensionnelle Purification et identification des peptides impliqués dans les complexes protéiques (stade du développement de la molécule)

49 ProteinChips

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