Surveillance microbiologique

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1 Surveillance microbiologique
de l’environnement - les surfaces - O. Meunier Service d’Hygiène Hospitalière et de Médecine Préventive - Hôpitaux Universitaires de Strasbourg -

2 Salles propres et environnements maîtrisés apparentés
Normes NF EN ISO 14698 Salles propres et environnements maîtrisés apparentés Maîtrise de la bio-contamination partie 1 : principes généraux et méthodes partie 2 : évaluation et interprétation des données de biocontamination Description des principes et des méthodes pour maîtriser de la bio-contamination d’un environnement Surveillance cohérente des zones à risque Appliquer des mesures adaptées

3 Maîtrise de la bio-contamination
Etablissement du système formalisé Analyse des risques - points critiques pour leur maîtrise (HACCP) Arbre de panne (AAP) Analyse des modes de défaillance et de leurs effets (AMDE)... Permet d’évaluer et de maîtriser les facteurs susceptibles d’avoir une incidence sur la qualité microbiologique du procédé et du produit Définir les niveaux cible, d’alerte et d’action Surveillance de la biocontamination Traitement des échantillons Culture des échantillons

4 Principes de maîtrise de la biocontamination
Identifier les dangers potentiels évaluer la probabilité que le danger se produise identifier les mesures préventives définir les zones à risque définir les modalités de prévention établir les limites de la maîtrise établir le plan de surveillance établir les actions correctives en cas de dérive établir les procédures validant la maîtrise former, rédiger.

5 Etablissement du système formalisé
Pour chaque zone à risque prendre en compte le risque de contamination air, surfaces, fréquentation... Niveau cible Niveau d’alerte Première alerte en cas de dérive par rapport aux conditions normales nécessite une attention accrue Niveau d’action nécessite une intervention immédiate, recherche de cause, action corrective Adaptés à la zone Accessibles Actualisés

6 Surveillance de la biocontamination
Par échantillonnage et dénombrement des unités viables (UV ou UFC) méthode appropriée Choisie en fonction : de la zone des particules viables recherchées des concentrations attendues des flores autochtones accessibilité méthode effet du prélèvement sur la zone précision attendue efficacité du prélèvement ...

7 Surveillance de la biocontamination
Par échantillonnage et dénombrement des unités viables (UV ou UFC) plan d’échantillonnage à chaque dépassement de seuil après arrêt prolongé des activités après les opérations de maintenance à chaque modification de procédé de production, de nettoyage, de désinfection… après des évènements inopinés pouvant contribuer à la bio-contamination En activité maximale et au repos Initial et actualisé choisir les sites en fonction de l’emplacement et de la fonction nombre fréquence méthodes volumes ou surfaces neutralisants évènements interférants...

8 Aucune précision sur la qualité du milieu !
Traitement des échantillons Prélèvement, transport, traitement ne doivent pas affecter ni la viabilité, ni le nombre des microorganismes prélevés. Milieux de culture et incubation choisis selon le type de microorganismes recherchés Milieux de culture non sélectifs additifs appropriés (inhibiteurs) Incubation appropriée 2 à 5 jours pour les bactéries 5 à 7 jours pour les champignons conditions atmosphériques compatibles Aucune précision sur la qualité du milieu !

9 Evaluations des données d’échantillonnage
Doit permettre d’engager des actions correctives efficaces Intérêt du dénombrement Intérêt de l’identification A définir A évaluer L’interprétation se fera surtout sur la base de l’historique des résultats obtenues dans la zone, sur le site...

10 Expression des résultats
Unités Viables (UV) ou Unités Formant Colonie (UFC) Le rapport d’essai doit comporter : type d’échantillon la méthode (numéro ou titre de la norme) le dispositif de prélèvement employé le site d’échantillonnage le type d’activité en cours, l’état d ’occupation le nombre de personnes présentes la date et l’heure, la durée du prélèvement la date d’examen des échantillons les conditions et durée d’incubation les modifications de méthode les résultats (numération et/ou identification) le nom de l’organisme chargé du rapport d’essai le nom et la signature du responsable des essais.

11 Modalités des prélèvements bactériologiques de surfaces
Effectuer des stries parallèles rapprochées sur la surface définie - tout en tournant l’écouvillon - Répéter le prélèvement sur la même surface en effectuant les stries dans le sens perpendiculaire au précédent remettre l’écouvillon dans un volume défini de liquide pour la numération la surface est nettoyée afin d’éliminer tout résidu nutritif Ecouvillons humidifié non standardisé toutes les surfaces

12 Modalités des prélèvements bactériologiques de surfaces
Surface étudiée de 20 cm2 pression uniforme de quelques secondes sans mouvement circulaire ou linéaire la surface est nettoyée afin d’éliminer tout résidu nutritif Empreintes gélosées standardisé : 500 g pdt 10 s ou 200 g pdt 2 min ou applicateur Count-Tact (25 g/cm2 +/- 10% pdt 10 s) surfaces planes

13 Modalités des prélèvements bactériologiques de surfaces
Calcul du rendement d’extraction par souche et par type de surface ! 8 à 10 prélèvements successifs sur la même zone - numération plus de 3 analyses calcul des moyennes Si l’on admet que la méthode à un rendement constant dans des conditions données. Le nombre de bactéries détachées varie logarithmiquement. L’équation de la cinétique de détachement est logNi = log a + i log b

14 logNi = log a + i log b NT = N1/(1-b)
Modalités des prélèvements bactériologiques de surfaces Calcul du rendement d’extraction par souche et par type de surface ! Ni = nbre de germe par unité de surface pour le prélèvement de rang i i = rang du prélèvement log a = ordonnée à l ’origine log b = coefficient angulaire de la droite logNi = log a + i log b Log b = -0.29 Pour E. coli sur du PVC A B C D E F 380 263 183 102 70 38 15 6 416 93 62 35 10 13 7 460 147 53 45 22 11 584 201 124 40 43 21 9 680 193 78 54 31 5 1 620 249 129 80 46 33 3 2 4 8 Ni log 523 191 105 59 37 27 9.5 3.2 2.72 2.28 2.02 1.77 1.57 1.43 0.98 0.5 Log Ni Rang de prélèvement NT = N1/(1-b) b = 0.52 NT = 523 /( ) = 1090

15 logNi = log a + i log b R = N1/NTx100 R = 48 %
Modalités des prélèvements bactériologiques de surfaces Calcul du rendement d’extraction par souche et par type de surface ! Ni = nbre de germe par unité de surface pour le prélèvement de rang i i = rang du prélèvement log a = ordonée à l ’origine log b = coefficient angulaire de la droite logNi = log a + i log b R = N1/NTx100 Pour E. coli sur du PVC N1 = 523 NT = 1090 R = 48 % A B C D E F 380 263 183 102 70 38 15 6 416 93 62 35 10 13 7 460 147 53 45 22 11 584 201 124 40 43 21 9 680 193 78 54 31 5 1 620 249 129 80 46 33 3 2 4 8 Ni log 523 191 105 59 37 27 9.5 3.2 2.72 2.28 2.02 1.77 1.57 1.43 0.98 0.5 Inox X2 carrelage X2 PVC X5 bois X10

16 Modalités des prélèvements bactériologiques de surfaces
Attention Grandes variations des résultats en fonction des couples bactérie / support testés étudiés PVC inox Très bonne adhésion sur l’inox E. coli 48 % 28 % S. aureus 37 % 21 %

17 1. Préparation d’une suspension de Staphylococcus aureus
ATCC à 105 UFC/ml dans de l’eau distillée stérile (EDS) Calcul du rendement d’extraction des empreintes gélosées pour le contrôle microbiologique des textiles 2. Contamination artificielle d’échantillons de textile tissé (polyester-coton) stérile, carré de 3 cm de côté, suivi d’un séchage sous flux laminaire 50l de suspension à 105 UFC/ml 50l d’EDS (témoin négatif) 3. Sur chaque échantillon de tissu (n=5) 10 prélèvements successifs sont réalisés à l’aide de boîtes Rodac contenant un milieu TCSA additionné de lécithine et de polysorbate poids de 200g appliqué pendant min boîte Rodac échantillon de tissu boîte de Pétri stérile 4. Incubation à 37°C pendant 24h puis dénombrement des colonies

18 1. Préparation d’une suspension de S. aureus
ATCC à 105 UFC/ml dans de l’eau distillée stérile Alternative à la technique des empreintes gélosées pour le contrôle microbiologique des textiles 2. Contamination artificielle d’échantillons de textile tissé (polyester-coton) stérile, carré de 3 cm de côté, suivi d’un séchage sous flux laminaire 50l de suspension à 105 UFC/ml 50l d’eau distillée stérile (témoin négatif) 3. Chaque échantillon (n=3) est placé dans un Erlen avec 10 ml d’eau distillée stérile (EDS) 10mL d’EDS 4. Sonication (12 min à 35 kHz) pour chaque échantillon, 6 extractions successives sont réalisées 4. Dénombrement des bactéries libérées du tissu à partir des suspensions obtenues à la fin de chaque extraction (sur milieu TCSA additionné de lécithine et de polysorbate).

19 Modalités des prélèvements bactériologiques de surfaces
avec neutralisants lecithine polysorbate 80 thiosulfate de sodium L-histidine Empreintes gélosées Ecouvillonnage, frottis Brossage, lavage-récupération Aspiration récupération Bioluminescence (ATPmétrie) technique recommandée par le CDC

20 Limites Eléments d’appréciation qualitatifs Faible surface investiguée
contamination très variable d’un site à l’autre conditions de survie variables (biofilm, matière organique) Microorganismes « stressés » Attention au taux de récupération ou rendement de la technique fonction de la technique de la surface de l’espèce bactérienne recherchée

21 Limites + inhibiteurs + inhibiteurs Choix des milieux
Milieux riches, milieux pauvres ? PCA ou PCSA ou PSA Gélose au sang de mouton Milieux sélectifs Bouillon thioglycolate pour les germes anaérobies Bouillon trypcase soja pour les germes aérobies Gélose count tact Biomérieux biotrypcase 15 g biosoyase 5 g NaCl g agar eau pH 7 + inhibiteurs Alginate, dissolution dans le bouillon + inhibiteurs +/- radiostérilisé

22 Dérivés mercuriels et hexochlorophène
Limites Les inhibiteurs Chlorhexidine Lecithine g/l Polysorbate 80 (tween 80) 5 g/l L Histidine g/l Thiosulfate g/l Phénols, aldéhydes Ammonium quaternaire Dérivés mercuriels et hexochlorophène Halogénés Tester l’efficacité des inhibiteurs

23 Interprétation Industrie alimentaire < 1 / cm2 excellent
2 à 10 / cm2 bon 11 à 100 / cm2 surface à nettoyer > 100 / cm2 arrêter la chaîne de production Satisfaisant < 10 abs Acceptable 11 à 100 1 à 10 abs non satisfaisant > 100 > 10 présence Flore totale / 10 cm2 Coliformes totaux / 10 cm2 Listeria

24 Interprétation Industrie alimentaire < 1 / cm2 excellent
2 à 10 / cm2 bon 11 à 100 / cm2 surface à nettoyer > 100 / cm2 arrêter la chaîne de production Zones à risques infectieux à l’hôpital risque UFC/25cm2 UFC/100cm2 4 < 5 < 10 3 < 5 < 100 2 < 50 < 1000 1 < 125 > 1000 Recommandation française Projet de norme européenne

25 Interprétation Zones à hauts risques infectieux UFC/boite
niveau d’action 25 niveau d’alerte 10 niveau cible 5 Aspec hors présence humaine + ou - 10 en présence humaine Zones à très hauts risques infectieux UFC/boite niveau d’action 10 niveau d’alerte 5 niveau cible < 1

26 Interprétation Faire des plans d’échantillonnage fonction des indications épidémie contrôle bactéries ou champignons pendant l’activité, après l’activité… Fréquence des prélèvements dépend aussi des indications Importance majeure de la comparaison des résultats entre eux, sur le long terme, avec la même méthode, même technicien… Définition de ses propres seuils sur la base de l’historique des résultats

27 À l’Hôpital

28 Olivier Meunier / Institut d’Hygiène / oct 2002
ENVIRONNEMENT Olivier Meunier / Institut d’Hygiène / oct 2002 INFECTIONS NOSOCOMIALES Eau Air Surfaces Réservoir de microorganismes Infections nosocomiales ? OUI pour - Aspergillus - Legionella - Mycobactéries - Pseudomonas... ? pour les autres microorganismes Hypothétique non démontré

29 Infections nosocomiales
Environnement AIR possibles Aspergillus fumigatus Legionella pneumophila EAU probables ? Pseudomonas aeruginosa Stenotrophomonas maltophilia SURFACES sans preuve Les surfaces peuvent elles constituer des réservoirs microbiens à l’origine de la contamination ?

30 Réceptivité du patient
Difficulté d’établir une relation de causalité entre le réservoir environnemental et la survenue d’infections nosocomiales Immensité du réservoir Analyse exhaustive impossible Représentativité de l’échantillonnage ? Modalités techniques Coût des analyses Inoculum suffisant Virulence Porte d’entrée Mode de contamination Réceptivité du patient infection colonisation Nombreuses étapes

31 Olivier Meunier / Institut d’Hygiène / oct 2002
ENVIRONNEMENT Olivier Meunier / Institut d’Hygiène / oct 2002 INFECTIONS NOSOCOMIALES épidémies Hypothétique non démontré Recherche d’un réservoir environnemental - Résultats positif - Comparaisons phénotypique et génotypique À l’origine du ou des cas ? ou Reflet de la présence du ou des cas ?

32 Olivier Meunier / Institut d’Hygiène / oct 2002
ENVIRONNEMENT Olivier Meunier / Institut d’Hygiène / oct 2002 INFECTIONS NOSOCOMIALES La maîtrise de l’environnement semble néanmoins indispensable à l’hôpital et nécessite un contrôle - Contrôle dans le cadre d ’une qualification d ’installation bloc opératoire, flux, circuits de dialyse… - Contrôle de surveillance maintenance, après travaux, définition des seuils - Contrôle d ’investigation recherche d ’un réservoir à l ’origine de cas - Contrôle à titre pédagogique visualisation sur les mains

33 Olivier Meunier / Institut d’Hygiène / oct 2002
ENVIRONNEMENT Olivier Meunier / Institut d’Hygiène / oct 2002 INFECTIONS NOSOCOMIALES Limites aux contrôles Attention aux techniques de prélèvement limites, reproductibilité, standardisation... Définir des seuils - cible - alerte - action Les contrôles ne sont pas - des prévisions de risque infectieux - des certificats de conformité - des certificats de bonne ou mauvaise conduite - des certificats de bonne conscience

34 Environnement Réservoir microbien
Grande diversité Bactéries : flore environnementale (Bacillus sp, Acinetobacter sp, Staphylococcus sp) flore humaine saprophyte (S. hominis, S. epidermidis, Acinetobacter baumannii…) flore humaine opportuniste (Pantoea agglomerans, Pseudomonas sp, S. maltophilia) flore humaine pathogène Virus Champignons : survie des levures (Rhodotorula, Candida sp) champignons filamenteux (grande variété, fréquence d’A. fumigatus) Parasites : Cryptosporidium parvum kystes d’amibes Giardia intestinalis Cyclospora microsporidies ATNC

35 Survie dans l’environnement
minutes heures jours semaines Herpes CMV Oreillons Rubéole Influenzae VRS Rotavirus Adenovirus Staphylococcus Rotavirus Adenovirus Hépatite A VRS B. pertussis H. influenzae N. meningitidis S. pneumoniae Hépatite B M. tuberculosis Acinetobacter Staphylococcus

36 Nettoyage et désinfection des surfaces
Bionettoyage Détergent-désinfectant : Réduction d’un log10 le nombre de bactéries sur une surface nettoyée Nettoyeur vapeur : Réduction d’un log10 Si l’on traite moins de 8 m2 en 2 minutes

37 NETTOYER - DESINFECTER Détergent-Désinfectant
Comment désinfecter ? NETTOYER RINCER DESINFECTER détergent eau Désinfectant NETTOYER - DESINFECTER RINCER eau Détergent-Désinfectant « On ne désinfecte que ce qui est propre » O. Meunier / Institut d’Hygiène / 2003

38 Détergent savon, produit vaisselle...
Comment désinfecter ? Détergent savon, produit vaisselle... Désinfectant formes végétatives VHB Rotavirus Spores bactériennes alcool à 70° Eau de Javel 3 à 6°Chl 1,2°Chl 0,5°Chl Adénovirus Détergent-Désinfectant Réservé à l’usage alimentaire O. Meunier / Institut d’Hygiène / 2003

39 Chiffonnette imprégnée avant le rinçage
Comment désinfecter ? Chiffonnette imprégnée Temps de contact de 15 minutes avant le rinçage Immersion Temps de contact de 15 minutes avant le rinçage Le séchage est recommandé O. Meunier / Institut d’Hygiène / 2003

40 Indications des prélèvements bactériologiques de surfaces
Contrôle de la qualité des procédures de bio-nettoyage Respect des procédures Recherche d’un réservoir à l’origine de cas groupés Pseudomonas aeruginosa Objet de bain contaminé en pouponnière Bain marie dans un service de greffe surfaces / erreur d’utilisation des détergents et dD Alcaligenes (Achromobacter) xylosoxidans Pantoea agglomerans Stenotrophomonas maltophilia Visualisation de la qualité microbiologique de l’environnement But pédagogique

41 Milieux riches ou milieux pauvres ?
Récupérer les bactéries à partir des surfaces bactéries « stressées » Milieux riches ou milieux pauvres ? Milieu TCSA Gélose au sang peptone de caséine 15 peptone de soja 5 NaCl Agar peptone 23 amidon 1 NaCl 5 Agar sang de mouton Autres milieux « pauvres » : PCA, R2A, TGA...

42 Récupérer les bactéries à partir des surfaces bactéries « stressées »
enrichissement Enrichissement ou non ? 18 à 24 h à 37°C bouillon nutritif amplification pas de quantification

43 360 prélèvements 78 (10.8 %) 96 (13.4 %) 496 (69.1 %) 650 (90.5.6 %)
Nombre d’espèces différentes : 718 Entérobactéries P. aeruginosa Staphylococcus sp Milieu TCSA 78 (10.8 %) 96 (13.4 %) 496 (69.1 %) 650 ( %) 718 12 (15 %) 11 (13.8 %) 71 (89 %) 79 (98.8 %) 80 17 (30.4 %) 20 (35.7 %) 42 (75.0 %) 55 (98.2 %) 56 29 (11.7 %) 45 (18.2 %) 136 (55.1 %) 247 (100 %) 247 Gélose au sang enrichissement Milieu TCSA Gélose au sang

44 Interprétation et expression des résultats
Exemples de réponse Interprétation et expression des résultats Staphylococcus epidermidis est un microorganisme de la flore cutanée humaine dispersé dans l’environnement par les mains. Nous avons montré que les souches isolées à proximité des malades sont très souvent méticillino-résistantes (60 %) et nous pensons que l’environnement peut jouer le rôle de réservoir secondaire à l’origine de la contamination des malades. Staphylococcus aureus est une bactérie de la flore humaine dispersée dans l’environnement par les mains. Elle est responsable de près de 20 % des infections nosocomiales.

45 Interprétation et expression des résultats
Exemples de réponse Interprétation et expression des résultats Acinetobacter baumannii est une bactérie de la flore cutanée humaine normale. Elle est de plus en plus souvent responsable d’infections nosocomiales. A l’hôpital, Acinetobacter baumannii est volontiers résistant aux antibiotiques (58 % expriment une céphalosporinase). Enterococcus, Streptocoque D, Enterobacter,... Sont des bactéries de la flore fécale humaine dont la dispersion dans l’environnement est manuportée. Ces bactéries sont fréquemment impliquées dans les infections nosocomiales.

46 Interprétation et expression des résultats
Exemples de réponse Interprétation et expression des résultats Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia... Sont des bactéries de la flore hydrique, colonisants les points d’eau et toutes les zones humides. Une décolonisation des siphons peut être effectuée régulièrement par 100 ml d’eau de Javel par exemple. Toutes ces bactéries doivent être éliminées des surfaces à proximité des malades par un nettoyage régulier et soigneux : S… à 0,25 %. Le lavage des mains très régulièrement permet d ’éviter la dispersion des microorganismes.

47 DIVERSITE DES ESPECES BACTERIENNES DANS LES PRELEVEMENTS
Résultats d’étude 1 DIVERSITE DES ESPECES BACTERIENNES DANS LES PRELEVEMENTS DE L’ENVIRONNEMENT A L’HOPITAL Roggy S., Winum A., Freyd A., Bientz M., O.Meunier Institut d’Hygiène, Faculté de Médecine, Strasbourg

48 DIVERSITE DES ESPECES BACTERIENNES DE L’ENVIRONNEMENT A L’HOPITAL
DANS LES PRELEVEMENTS DE L’ENVIRONNEMENT A L’HOPITAL Bacillus cereus 10/53 B. licheniformis 9/53 B. pumilus 4/53 B. lentus 2/53 B. circulans 1/53 B. brevis 1/53 B. sphaericus 1/53 B. subtilis 1/53 Paenibacillus pabulis 1/53 non identifié 12/53 Enterococcus faecalis 50% Enterococcus sp non faecalis

49 A B C D SALLE DE SOIN (loin du malade) CHAMBRE (près du malade)
près de l’eau loin de l’eau A B C D

50 DIVERSITE DES ESPECES BACTERIENNES DE L’ENVIRONNEMENT A L’HOPITAL
DANS LES PRELEVEMENTS DE L’ENVIRONNEMENT A L’HOPITAL A B C D Staphylococcus epidermidis 49/ S. hominis 18/ S. warneri 14/ S. haemolyticus 13/ A B C D

51 DIVERSITE DES ESPECES BACTERIENNES DE L’ENVIRONNEMENT A L’HOPITAL
DANS LES PRELEVEMENTS DE L’ENVIRONNEMENT A L’HOPITAL A B C D Acinetobacter baumanii 17/ A. lwoffi 17/ A. calcoaceticus 4/ A. johsonii 1/43 1 identification incertaine (A. baumanii ou lwoffi) 4/ A B C D

52 ETUDE DE LA SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES
Résultats d’étude 2 ETUDE DE LA SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES DES PRINCIPALES ESPECES BACTERIENNES ISOLEES DANS L’ENVIRONNEMENT HOSPITALIER Vidinic J., Roggy S., Freyd A., Bientz M., O.Meunier Institut d’Hygiène, Faculté de Médecine, Strasbourg

53 STAPHYLOCOQUES A COAGULASE NEGATIVE
SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES DES PRINCIPALES ESPECES DE STAPHYLOCOQUES A COAGULASE NEGATIVE A B C D S. epidermidis Méticillino-résistant S. hominis Méticillino-résistant S. warneri Méticillino-résistant S. haemolyticus Méticillino-résistant A B C D

54 A B C D PSEUDOMONAS AERUGINOSA
SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES DES SOUCHES DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA ISOLEES DANS L’ENVIRONNEMENT HOSPITALIER A B C D Pseudomonas aeruginosa phénotype sauvage pénicillinase (Pase) céphalosporinase (CHN) imperméabilité (IMP) IMP + Pase IMP + CHN A B C D

55 D’UNE SOURCE ENVIRONNEMENTALE A L’ORIGINE DE LA CONTAMINATION DE
Résultats d’étude 3 RECHERCHE D’UNE SOURCE ENVIRONNEMENTALE A L’ORIGINE DE LA CONTAMINATION DE 2 PATIENTS INFECTES PAR ENTEROBACTER CLOACAE

56 COMPARAISON PAR ELECTROPHORESE EN CHAMP PULSE DES PROFILS DE MIGRATION
DE SOUCHES ENTEROBACTER CLOACAE Pourcentage d’homologie 4 5 6 7 8 9 1 F 8. Env 12. Env 10. Env 11. Env 4. Env 5. Env 6. Env 1. cas clinique 1 R 2. cas clinique 2 S 3. cas clinique 2 R 7. Env 9. Env I H H B C D A A A E G

57 MISE EN EVIDENCE DE LA PARTICIPATION DE L’ENVIRONNEMENT
Résultats d’étude 4 MISE EN EVIDENCE DE LA PARTICIPATION DE L’ENVIRONNEMENT A LA DISSEMINATION DE SOUCHES DE S. AUREUS O. meunier, Ph. Petitjean, C. Hernandez, N. de Almeida

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62 Autres exemples • Epidémie à enterobacter aerogenes
• Cas groupés d’infection à C. difficile • Cas groupés d’infection à Enterococcus faecium