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HEMOPHILIE: la place du laboratoire JF SCHVED Centre Régional de Traitement des Hémophiles Laboratoire dHématologie CHU Montpellier.

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1 HEMOPHILIE: la place du laboratoire JF SCHVED Centre Régional de Traitement des Hémophiles Laboratoire dHématologie CHU Montpellier

2 Diagnostic Suivi thérapeutique Dépistage des complications: inhibiteurs HEMOPHILIE: la place du laboratoire

3 SYNDROME HEMORRAGIQUE: BILAN 4 Examens: l Numération plaquettaire l Temps de Quick (TP) l Temps de Céphaline + activateur l Fibrinogène

4 ALLONGEMENT DU TEMPS DE CEPHALINE + ACTIVATEUR l Quand parler dallongement du temps de céphaline + activateur –Toujours en référer au «temps du témoin», que le laboratoire doit indiquer –Temps de céphaline + activateur anormal si TCA malade TCA Témoin > 1,2* * Chez lenfant: 1,3

5 XII XI IX VIII VII X II I Caillot PL V Activateur EXPLORATION DE LA COAGULATION

6 XII XI IX VIII VII X II I Caillot PL V Temps de Quick Facteur tissulaire Calcium

7 XII XI IX VIII VII X II I Caillot Céphaline V Temps de céphaline +activateur Activateur acide ellagique silice kaolin Calcium

8 XII XI IX VIII VII X II I V TCA TQ Nl

9 XII XI IX VIII VII X II I V TCA TQ Nl Avec syndrome hémorragique

10 FACTEUR VIII : Différentes techniques de dosage l Dosage fonctionnel (activité) –Chronométrique –Chromogénique l Dosage de la protéine (antigène)

11 Le dosage du facteur VIII Réactifs: Plasma déficient en facteur VIII Réactif TCa Calcium Principe Droite d'étalonnage: dilutions en tampon pH 7,35 Dilution 1/20 (100%), 1/40 (50%), 1/80 (25%), 1/160 (12,5%), 1/320 (6,5%) Dilutions du plasma à tester HEMOPHILIE: la place du laboratoire

12 DOSAGE FACTEUR VIII 48,1 53,6 60,3 68,6 78,6 4,5511,3822,7545,591,0 O O O O O Concentrations (%) Sec O 1/4 O 1/2 O 1/1

13 VARIABLES PRE-ANALYTIQUES l Tube: type, anticoagulant, remplissage.., hématocrite.. l Prélèvement: garrot, matériel à prélèvement, cathéter, place du tube.. l Transport: délai, température.. l Conditionnement au labo: centrifugation, congélation, conservation, décongélation..

14 DOSAGE CHRONOMETRIQUE du FVIII l Facteurs influençant la précision: –Appareillage –TCA : réactif utilisé –Plasma déficient contenant tous les facteurs sauf FVIII (Plasma humain lyophilisé) –Plasma à tester dilué: 2 dilutions extemporanées (1/10; 1/20 +++)

15 F VIII: Contrôle de Qualité ECAT ECAT n° 2/2005 FVIIInmoyenneCV % limitesVotre résultat Groupe total Test en 1 temps Test en 2 temps Activateur Actin FSL Pathromtin SL PTT autom. stago

16 l Déficit biologique Facteur VIII –Hémophilie A congénitale –Hémophilie acquise –Maladie de Willebrand l Déficit biologique Facteur IX –Hémophilie B congénitale –Hypovitaminose K partielle ou débutante l Déficit biologique en facteur XI –Déficit congénital en facteur XI TCATQ Nl avec syndrome hémorragique

17 Classification des hémophilies Taux de facteurClassification < 0.01 IU/ml (< 1%)sévère IU/ml (1%-5%)modérée > %-< 40%)mineure 1 IU/ml = 100% World Health Organization International Standard T & H 2001 Scientific subcommittee on FVIII and FIX Valeurs normales = % (établies dans chaque laboratoire)

18 Diagnostic Suivi thérapeutique Dépistage des complications: inhibiteurs HEMOPHILIE: la place du laboratoire

19 PHARMACOCINETIQUE - Récupération : Taux maximal et evolution dans le temps du taux de FVIII ou IX dans le sang circulant après une perfusion dune quantité donnée de facteur anti-hémophilique. - Demi-vie : Temps au bout duquel il reste 50 % du taux maximum de FVIII ou IX circulant.

20 CINETIQUE FAH: Protocole Doses à injecterprélèvements - pour le FVIII : 25 U/kg -pour le FIX : 50 U/kg -avant le prélèvement -à 10 min -à 30 min -à 1h -à 6h -à 12 h -à 24h

21 DOSAGE F VIII pour CINETIQUE l Technique: –Méthode de coagulation en 1 temps l Particularités –Dosage de Refacto R l Préférer le dosage chromogénqique l Standard Refacto

22 CINETIQUE F VIII Injection de 25UI/kg FVIII; ½ vie 8 h Récupération 2U/dl/U/kg; FIX; ½ vie 12 h Récupération 1U/dl/U/kg

23 EXEMPLE DE CINETIQUE F VIII Patient de 90 Kg Temps en heures Activité F VIII (en %) FVIII 2250 UI 1 - Calcul de la récupération = (49-1)x90 : 2250 = 1.92 % par U/ kg - Demie vie = 9 h

24 Pharmacocinétique: limites l Méthodes de dosage –FVIII:C et FIX:C l Recommandations FVIII/FIX subcommittee of SSC of the ISTH l Récupération in vivo –Volume de distribution = vol. plasmatique du patient l Faux pour le FIX l non constant dans le temps l activation post-perfusion l Demi-vies –2 ou 3 phases l Rapide = équilibre distribution vol. plasmatique (3-6h) l Plateau = taux initial l Finale = dégradation du FVIII (15-17h)

25 Diagnostic Suivi thérapeutique Dépistage des complications: inhibiteurs HEMOPHILIE: Les inhibiteurs

26 DEPISTAGE des INHIBIBITEURS: Quand le faire? l Systématiquement tous les 3 mois ou toutes les 5-10 substitutions chez l'hémophile sévère et jusqu'à 100 jours cumulés d'exposition au produit (JCPA), puis 1-2 fois par an l Avant (15j) et après une chirurgie ou un traitement intensif l Inefficacité ou efficacité partielle d'une perfusion de FAH

27 Mise en évidence d'un inhibiteur: comment? l Mise en évidence d'un effet inhibiteur in vitro –Bethesda l Courbe de récupération

28 Les premières méthodes l Principe : mesure de la capacité à inhiber lactivité procoagulante du FVIII l Dépistage puis Titrage l Qualitatif : dilution de plasma contenant linhibiteur + quantité fixe de FVIII New Oxford 1973 Bethesda 1975 Plasma concentré Pool de plasma normaux

29 DEPISTAGE des ANTI F VIII l Incubation ( 1:1, 2 h à 37°) : –Plasma titré à 100% de F VIII + plasma à tester –Plasma titré à 100% + tampon l Dosage du FVIII résiduel –Dans le mélange plasma 100% + plasma à tester –Dans le mélange plasma 100% + tampon Dans ce mélange, le taux de VIII attendu est environ de 50% l Interprétation La présence dun anti VIII se traduit par une diminution du taux de FVIII dans le mélange « référence+malade » En labsence dAc le taux de FVIII est identique a celui retrouvé dans le mélange « référence+tampon »

30 Biologie: Dépistage anti FVIII T° 1 vol. Plasma maladeTampon Plasma titré à 100% 50% de FVIII< 50 % de FVIII

31 TITRAGE de l'Anti FVIII (Bethesda) Taux de FVIII résiduel (malade+référence) Taux de FVIII résiduel (tampon+référence) Taux de FVIII résiduel corrigé - Taux résiduel corrigé reporté sur un abaque reliant les UB et les taux résiduels corrigés - 1UB = quantité dAc neutralisant 50% du plasma de référence = 50% dactivité résiduelle corrigé X 100

32 Modification de Nijmegen l Technique classique : manque de spécificité –notamment sur les valeurs basses l Tamponner le plasma normal ainsi que le mélange contrôle l Remplacer le tampon de léchantillon contrôle par du déficient FVIII immunodéplété –pour éviter la chute du pH pendant lincubation : faux + par inactivation du FVIII:C indépendant des Ac

33 HEMOPHILIE : Rôle du laboratoire l Indispensable pour diagnostic –Permet aussi de classer les hémophilies –Problèmes de variabilité inter-laboratoire –Mais la sévérité est un paramètre clinique l Indispensable pour dépistage, titrage et suivi des inhibiteurs l Indispensable pour adaptation thérapeutique –Cinétique à mise en place d'un traitement, lors d'un changement de traitement, avant chirurgie Parfois nuisible en urgence


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