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Exploration hémostase primaire – actualités 2007 Pr Thomas Lecompte, Service dHématologie Biologique, CHU Nancy.

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1 Exploration hémostase primaire – actualités 2007 Pr Thomas Lecompte, Service dHématologie Biologique, CHU Nancy

2 Exploration de lhémostase primaire en 2007 : moyens de base numération plaquettaire hématocrite TC+A / VIII-Willebrand thrombopénies + morphologie anémies anomalies du f v W

3 Exploration de lhémostase primaire en 2007 : facteur von Willebrand Triade classique : TS Num. plaq. Normale TC+A (F.VIII )

4 Exploration de lhémostase primaire en 2007 : facteur von Willebrand Triade classique : TS Num. plaq. Normale TC+A (F.VIII ) f v W - antigène - - cofacteur ristocétine - - liaison au collagène etc.

5 Exploration de lhémostase primaire en 2007 : facteur von Willebrand Triade classique : TS Num. plaq. Normale TC+A (F.VIII ) f v W - antigène - - cofacteur ristocétine - - liaison au collagène etc. pièges : Thrombopénie Antigène normal F.VIII isolément

6 Numération plaquettaire Facteur von Willebrand Tests globaux : - Temps de Saignement TS - dispositifs in vitro (type PFA-100) Fonctions plaquettaires in vitro Exploration de lhémostase primaire en 2007 : moyens

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8 Exploration de lhémostase primaire en 2005 : moyens de base / 2 Temps de Saignementtest global in vivo

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13 PFA 100 (Platelet Function Analyzer) test in vitro Mesure du temps docclusion en sang totalfluxcontraintes de cisaillement Principe : évaluation de la capacité dactivation des plaquettes en sang total en condition de flux avec contraintes de cisaillement élevées

14 UTILITE CLINIQUE PFA-100 ? TL fév 2003 question clairement posée compréhension des phénomènes intervenant dans lévolution clinique et de ceux mis en jeu dans le test qualités métrologiques bonnes, conditions de réalisation du test établies (notamment aspects préanalytiques) performances diagnostiques …

15 PFA 100 (Platelet Function Analyzer) Dépendant de la NP et de lhématocrite Sensible aux interactions avec le facteur von Willebrand : GPIb/FvW GPIIb/IIIa / FvW-collagène

16 PFA 100 (Platelet Function Analyzer) Dépendant de la NP et de lhématocrite Sensible aux interactions avec le facteur von Willebrand : GPIb/FvW GPIIb/IIIa / FvW-collagène Détecte les atteintes de la voie du thromboxane Peu sensible à celles de la voie de lADP

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18 Fonctions plaquettaires in vitro : Tests d agrégation Cytométrie en flux

19 Test d agrégation plaquettaire 37°C PRPPPP PRP + agoniste temps % agrégation Les plaquettes, en quantité suffisante, sont capables dagréger après stimulation par différents agonistes. Détection (le + souvent) par méthode photométrique : éclaircissement du milieu dû aux agrégats plaquettaires

20 Cazenave, EFS Alsace, Inserm U311

21 Test d agrégation plaquettaire Agrégamètres SODEREL MEDICAL, France Les plaquettes, en quantité suffisante, sont capables dagréger après stimulation par différents agonistes. Détection (le + souvent) par méthode photométrique : éclaircissement du milieu dû aux agrégats plaquettaires

22 Influence du pré-analytique +++ Préparation des plaquettes Qualité du prélèvement Proportion citrate/plasma Traumatismes liés au pipetage et centrifugation Contamination par GR et GB ConservationTempérature (ambiante) Interface air/liq (bulles) pH-CO 2 (alcalinisation du plasma) Déroulement des tests NP ( G/L) Propreté des cuves Température (37°C) Agitation Homogénéisation plaquettes/agoniste Délai< 3h après prélèvement

23 Test dagrégation plaquettaire Paramètres étudiés : Paramètres étudiés : Agonistes en 1 ère intention : - max de transmission lumineuse - Allure de la courbe : vagues, réversibilité - Allure de la courbe : vagues, réversibilité - Temps de latence (collagène)

24 Réponse avec temps de latence : 30 à 60s Mécanisme : –Adhésion de qq plaquettes aux fibres de collagène –Sécrétion ADP (grains δ) et synthèse TXA 2 –Activation des autres plaquettes A forte C ion, AP indépendante du TXA 2 (mobilisation Ca 2+ i ) intérêt de tester 2 concentrations (faible et forte) Réponse au collagène Explore : - Possibilité dadhérence au collagène (GPIb/IX/V) - Perturbation des système damplification (TXA 2, sécrétion)

25 AA métabolisé par la voie des COX pour former le TXA 2 TXA 2 inhibe ladénylate synthase plaquettaire : AMPc et Ca 2+ i Activation plaquettaire Réponse à lacide arachidonique Explore : - Voie damplification liée au TxA 2 - Réponse aux inhibiteurs des COX (aspirine et AINS)

26 Récapitulatif

27 activateur plaquettaire Permet la fixation du vWF plasmatique avec GPIb plaquettaire => AGGLUTINATION,Ristocétine

28 Effet de l aspirine sur lagrégation plaquettaire (appareils Soderel) Profil normal Effet principal Répercussions Profil aspirine

29 Exemple de thrombopathie : Thrombasthénie de Glanzmann

30 Autres tests permettant dévaluer la fonctionnalité plaquettaire -Tests plus spécifiques permettant une exploration « ciblée » Tests de sécrétion : Tests de sécrétion : - sécrétion ATP : test luciférine/luciférase - CMF : test à la mépacrine Expression des Gp plaquettaires (CMF) Expression des Gp plaquettaires (CMF)

31 Cytométrie en Flux

32 Grains denses Granules P-sélectine) Plaquette au repos GP IIb/IIIa GP Ib/IX/V Will collagène

33 Exploration des granules alpha plaquettaires par CMF Trousse Platelet Gp Biocytex – Diagnostica Stago Etat basalActivation TRAP Etat basalActivation TRAP GPIIbIIIa CD41a 53,585, GPIb CD42b 42,725, Résultats exprimés en nb de sites occupés par lanticorps x10 3 /plaquette Patient Valeurs de références - -Absence danomalie dexpression à létat basal - -Bonne réactivité plaquettaire après stimulation par le TRAP

34 Activation plaquettaire Grains denses Granules P-sélectine) Plaquette au reposPlaquette activée activation GP IIb/IIIa GP Ib/IX/V Will collagène

35 Exploration des granules alpha plaquettaires par CMF Trousse Platelet Gp Biocytex – Diagnostica Stago Etat basalActivation TRAP Etat basalActivation TRAP GPIIbIIIa CD41a 53,585, GPIb CD42b 42,725, GMP140 CD62P 0,811,8<1>1 Résultats exprimés en nb de sites occupés par lanticorps x10 3 /plaquette Patient Valeurs de références - -Absence danomalie dexpression à létat basal - -Bonne réactivité plaquettaire après stimulation par le TRAP

36 Test à la mépacrine par CMF : Prélèvement : sang veineux recueilli en présence de citrate. Réalisation dun PRP. Principe la mépacrine, dérivé de la quinacrine, capturé de façon sélective par les grains denses et non par les grains et émets une fluorescence verte après excitation à 488 nm. Phase de capture : incubation des plaquettes au repos en présence de mépacrine. Les plaquettes internalisent la mépacrine dans les grains denses, rendant les plaquettes fluorescentes. Phase de sécrétion : les plaquettes activées par la thrombine, relarguent la mépacrine dans le milieu extra-cellulaire ce qui entraîne une diminution de leur fluorescence. Exploration des granules denses plaquettaires par CMF

37 Étude de la capture/sécrétion de mépacrine par cytométrie en flux (Wall JE, 1995) Capture de mépacrine Sécrétion de mépacrine (stimulation plaquettaire : thrombine 0,4 UI/mL) x3,60 /2,21 Diminution de la capture et de la sécrétion de mépacrine par les plaquettes

38 Mesure de lexpression de CD63 par CMF : Principe: le CD63 est un marqueur de la membrane des granules denses Analyse à létat basal : mesure de la fluorescence des plaquettes après immunomarquage par un Ac anti-CD63-FITC. Analyse après stimulation plaquettaire par la thrombine : les plaquettes activées par la thrombine sécrètent leur granule dont leur membrane vient saccoler à la membrane plasmique, ce qui entraîne une augmentation de lexpression de CD63, soit une augmentation de la fluorescence liée à limmunomarquage anti- CD63-FITC. Exploration des granules denses plaquettaires par CMF

39 Étude de lexpression membranaire de CD63 par cytométrie en flux Expression membranaire de CD63 (stimulation plaquettaire : thrombine 0,4 UI/mL) Diminution de lexpression de CD63 après stimulation plaquettaire X1,99

40 Exploration de la signalisation voie ADP par CMF

41 Anomalie de réponse à lADP ? (appareils Soderel)

42 P2Y 12 Réponse à lADP

43 AC PGE1 AMPc PKA VASP VASP-P PP Plaquette non activée Adapté daprès Horstrup et al. Eur J Biochem 1994, 225 : 21-7 ADP-- - P2Y 12 Platelet VASP-FCM Biocytex

44 Autres tests permettant dévaluer la fonctionnalité plaquettaire - Nouveaux tests permettant dévaluer la réponse aux traitements antiplaquettaires Appareils de biologie délocalisée (VerifyNow) Appareils de biologie délocalisée (VerifyNow) Test VASP Test VASP

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47 Appareil VerifyNow

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49 EN CONCLUSION… 2007 question clairement posée (clinique) TS : de moins en moins utilisé Num plaq + morphologie vWF thrombopathies majeures -SPD coag : W Noramandie /activités procoagulantes plaquettaires thrombopénies constitutionnelles

50 Exploration hémostase primaire Véronique Latger-Cannard Marie Toussaint-Hacquard Service dHématologie Biologique, CHU Nancy


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