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Master "Ingénierie pour la Santé" Option "Ingénierie Médicale" Sophie PINEL Laboratoire dHistopathologie Expérimentale et Moléculaire – EA 4001 Faculté

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Présentation au sujet: "Master "Ingénierie pour la Santé" Option "Ingénierie Médicale" Sophie PINEL Laboratoire dHistopathologie Expérimentale et Moléculaire – EA 4001 Faculté"— Transcription de la présentation:

1 Master "Ingénierie pour la Santé" Option "Ingénierie Médicale" Sophie PINEL Laboratoire dHistopathologie Expérimentale et Moléculaire – EA 4001 Faculté de Médecine, Bât D 1 er étage 9 avenue de la Forêt de Haye VANDIEUVRE LES NANCY Tél : Culture de cellules animales

2 INTRODUCTION GENERALE Modèles détudes en biologie animale ( biologie végétale) Organe isolé Cellules en culture Fractions cellulaires isolées (Fractions subcellulaires, macromolécules) Organisme entier Homme Animal COMPLEXITE +- Environnement artificiel pour croissance et/ou fonction Homogénéité Relations intersystèmes Liens intercellulaires normaux rompus

3 CULTURE DE CELLULES ANIMALES 1. DIFFERENTS TYPES DE CULTURES CELLULAIRES 1.1. Méthodes dobtention des cellules cultivées Isolement à partir dun liquide ou dun tissu biologique Achat auprès dun organisme certifié American Type Culture Collection (ATCC) European Collection of Cell Cultures (ECACC) Monoclonal avec caractéristiques définies, qualité contrôlée mais onéreux Echanges entre laboratoires Qualité non garantie : risques de contamination ++

4 CULTURE DE CELLULES ANIMALES 1.2. Cultures primaires – Cultures secondaires Cultures primaires Isolement à partir dun organe ou dun tissuCellules adhérentes Culture dexplants Après quelques jours Fragment dorgane/de tissu Milieu de culture adapté Dissociation mécanique et enzymatique Action mécanique (broyer, émincer) Action denzymes protéolytiques (trypsine, collagénase) Suspension cellulaire Mise en culture Plusieurs types cellulaires (fibroblastes dominants) Purifier pour système monoclonal Méthodes de clonage Méthodes de séparation physique (centrifugation sur gradient de densité, chromatographie daffinité, cytométrie de flux, électrophorèse, séparation par billes magnétiques) Sang : lymphocytes, cellules leucémiques Liquide pleural, liquide dascite : cellules tumorales Cellules circulantes Isolement à partir dun liquide biologique Centrifugation sur gradient de densité, ou trieur de cellule Cultures secondaires Cultures établies par repiquage successifs de cellules déjà mises en culture (cultures primaires ou secondaires, cellules achetées, …)

5 CULTURE DE CELLULES ANIMALES 1.3. Cultures finies – Cultures continues Cultures finies Cultures continues Après X repiquages (env. 30 à 60 mitoses/divisions), division cellulaire stoppée, mort cellulaire par apoptose Cultures cellulaires à durée de vie limitée Cellules en cultures capables de se diviser indéfiniment Cellules somatiques issues de tissus normaux Cellules ayant des propriétés dIMMORTALITE Immortalité innée : cellules souches Immortalité acquise : CELLULES TRANSFORMEES = cellules tumorales Cultures primaires puis secondaires à partir dune tumeur animale ou humaine Cultures primaires puis secondaires à partir dun tissu normal : transformation in vitro (agents chimiques, radiations, virus) (+) : Culture illimitée dans le temps, manipulation plus facile et croissance plus rapide ( -) : instabilité génomique, pertes des propriétés morphologiques et fonctionnelles initiales

6 CULTURE DE CELLULES ANIMALES 1.4. Cellules adhérentes – Cellules en suspension Cellules adhérentes Dépendance vis-à-vis de lancrage = Nécessité dêtre attachées entre elles et ancrées sur un support pour survivre Cultures en monocouche Cultures tridimentionnelles = sphéroïdes Ensemencement dans des boîtes de culture : les cellules adhèrent au fond, puis se divisent, se placent les une à côté des autres jusquà former un tapis cellulaire. Cellules mises en culture en suspension dans le milieu et maintenues sous agitation lente afin de favoriser laccrochage des cellules entre elles: formation damas sphériques au sein desquels les cellules se divisent Boîte de Pétri, Flacon de culture, Plaques multipuits Spinner Cellules issues de tissus normaux, la plupart des cellules issues de tumeurs solides.

7 CULTURE DE CELLULES ANIMALES Cellules en suspension Indépendance vis-à-vis de lancrage Ex : Cellules issues du sang, cellules leucémiques Cellules mises en culture en suspension dans le milieu de culture (avec ou sans agitation) et se multiplient ainsi Boîte de Pétri, Flacon de culture, Plaques multipuits 1.4. Cellules adhérentes – Cellules en suspension (suite) Remarque : Récipients en verre Récipients en plastique +/- pré-traitement Systèmes matriciels simulant la matrice extracellulaire

8 CULTURE DE CELLULES ANIMALES 1.5. Types cellulaires cultivés Identification par rapport au système dont les cellules dérivent Caractéristiques morphologiques Caractéristiques fonctionnelles +/- conservées Cellules de type lymphoblastique Cellules de type épithélial Ancrage indispensable, polygonales, et aplaties, très serrées Cellules de type fibroblastique Ancrage indispensable, allongées et bipolaires, filaments Cellules de type endothélial Ancrage indispensable, polygonales, petite taille Cellules de type neuronal Ancrage indispensable, un corps central et départ de dendrites En suspension, forme sphérique Rque : Influence des conditions de culture

9 CULTURE DE CELLULES ANIMALES Hybridomes Cellules hybrides obtenues par fusion de deux cellules appartenant à des types différents mais apparentés Intérêt : Combiner les propriétés des 2 types cellulaires Ex : Lymphocyte issu de la rate capable de produire un anticorps défini + Cellules de myélome se divisant très rapidement et possédant la machinerie pour produire des anticorps mais lutilisant pas = Hybridome capable de produire un très grande quantité de lanticorps désiré Intérêt industriel, diagnostique et clinique 1.5. Types cellulaires cultivés (suite)

10 CULTURE DE CELLULES ANIMALES 2. CROISSANCE DES CELLULES EN CULTURE IN VITRO 1 : phase de latence, 2 : phase de croissance exponentielle, 3 : phase de ralentissement, 4 : phase stationnaire, 5 : phase de déclin Les différentes phases de la croissance 2.1. Le repiquage des cultures cellulaires Lavage du tapis cellulaire (PBS) Détachement des cellules par action enzymatique (trypsine, collagénase à 4° ou à 37°C)

11 CULTURE DE CELLULES ANIMALES 2.3. Cryoconservation des cellules Cellules peuvent être congelées Éviter les passages trop nombreux = vieillissement de la population cellulaire Permet dinterrompre lactivité Azote liquide Cryoconservateur : DMSO, glycérol Descente progressive en température

12 CULTURE DE CELLULES ANIMALES 3. CONDITIONS ET DIFFICULTES DE LA CULTURE CELLULAIRE 3.1. Eviter les contaminations Contaminations chimiques Contaminations biologiques Endotoxines, résidus plastiques, ions métalliques, traces dagents nettoyants/désinfectants, etc… Effets invisibles, produits difficiles à détecter Levures, bactéries, champignons Effets généralement visibles, facile à détecter Modification du pH et de la turbidité du milieu Virus, mycoplasme Effets invisibles, détection possible par analyse spécifique Détection de mycoplasme : marquage de lADN des cellules avec du Hoechst NégatifPositif

13 CULTURE DE CELLULES ANIMALES Moyens de lutte contre les contaminations Environnement et surfaces propres Consommable utilisé adapté (fournisseur certifié) Equipement, récipients plastiques et verre propres et stérilisés Milieux de culture stériles Maintenir la stérilité des cultures et des milieux HOTTE A FLUX LAMINAIRE VERTICAL ou POSTE DE SECURITE MICROBIOLOGIQUE Filtre HEPA (high efficiency particule air) Lampe UV Protection des cultures, milieux, plastiques Protection de lenvironnement Protection du manipulateur (vitre à lavant)) Air ambiant Air contaminé Air stérile Usage dantibiotiques, dantifongiques

14 CULTURE DE CELLULES ANIMALES 3.2. Trouver les conditions de culture optimales Critères de jugement Environnement optimal les cellules ne meurent pas les cellules se divisent les cellules reproduisent in vitro les fonctions physiologiques ou biochimiques connues in vivo obligatoires Les critères dévaluation Viabilité cellulaire Taux de croissance Morphologie Efficacité densemencement (dilution de la culture et formation de colonie) Expression de fonctions spécifiques Microscope en phase inversée, bleu trypan, numération à lhémocytomètre

15 CULTURE DE CELLULES ANIMALES 3.2. Trouver les conditions de culture optimales (suite) Paramètres de lenvironnement à contrôler Le milieu de culture Milieux complexes qui doivent apporter tous les éléments nutritifs nécessaires à la croissance/prolifération des cellules animales Eau Ions minéraux nombreux et variés en concentration adéquate (Na +, K +, Cl -,HCO3 -, H 2 PO 4 2- ) Source de carbone et dénergie : le plus souvent glucose Eléments de constitution : acide aminés essentiels +/- non essentiels, + glutamine acides gras, cholestérol, vitamines + cofacteurs, riboses et désoxyribose Antibiotiques +/- antifongiques : pénicilline G, streptomycine, +/- amphotéricine B Facteurs de croissances divers (FGF, EGF, PDGF, IL-2, etc…) Sérum de veau fœtal (1,5 à 10%) décomplémenté Les paramètres physico-chimiques Température : 37°C GAZ : O 2 et CO 2 Osmolarité avoisinant celle du sérum physiologique (300 mOsm/L) Rôle des ions, contrôle les mouvements deau et de substances entre milieux extra et intra-cellulaire pH compris entre 7,0 et 7,4En particulier HCO 3 - /CO 2, système tampon Hygrométrie : 80% dhumidité Eviter évaporation du milieu INCUBATEUR A CO 2 Contrôle de la température, hygrométrie, 5% de CO 2

16 CULTURE DE CELLULES ANIMALES 4. DOMAINES DAPPLICATION Culture cellulaire = Outil majeur en biologie animale 4.1. Modèle détude Etude des propriétés biologiques et biochimiques des cellules Etude des liens entre les causes dune maladie/anomalie et ses répercussions sur la cellule Etude des effets dun agent chimique sur les cellules Etude du processus de vieillissement cellulaire +/- comment interagir Etude nutritionnelle 4.2. Support aux tests de toxicité Etude des conséquences toxiques dun nouvel agents chimiques, cosmétiques, pharmaceutiques En aval des essais chez les animaux Cellules hépatiques et rénales 4.3. Recherche en cancérologie Différence entre cellules normales et tumorales Etude des agents transformants = cancérigènes Screening de nouveaux médicaments anticancéreux

17 CULTURE DE CELLULES ANIMALES 4.4. Virologie Etude de la réplication et des propriétés des virus. Etude des mécanismes dinfection par les virus Etude de lefficacité des antiviraux 4.5. Applications industrielles Production danticorps monoclonaux (diagnostic, clinique, recherche) Production de protéines de synthèse (insuline, facteur de croissance) Production de virus en grande quantité pour préparation des vaccins Production de tissus de substitution : thérapie cellulaire (cornée, peau) +/- essais !!! 4.6. Etudes génétiques Analyses diagnostiques sur le caryotype, les chromosomes, lADN 4.7. Génie génétique, thérapie cellulaire et thérapie génique Réintroduction de gènes fonctionnels dans les cellules à visée thérapeutique Introduction de gènes dans les cellules pour en modifier les propriétés dexpression (recherche, application clinique ?)


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