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DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DE LA SYPHILIS Dr Patrice Sednaoui Institut Alfred Fournier Paris.

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1 DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DE LA SYPHILIS Dr Patrice Sednaoui Institut Alfred Fournier Paris

2 Histoire naturelle de la maladie Connue depuis la fin du XVème siècle en Europe Infection dévolution lente entraînant des complications tardives cardiovasculaires et neurologiques. Schaudinn et Hoffman en 1905 : bactérie spiralée mobile au microscope au fond noir. Wassermann, Neisser et Brucker : RFC pour le diagnostic indirect, utilisant lAg cardiolipidique. Pénicilline utilisée dès 1940 pour traiter efficacement la syphilis et les tréponématoses endémiques.

3 Histoire naturelle de la maladie T. pallidum : transmission sexuelle (risque 1/3) Transmission mère-enfant : risque faible avant 3.5 mois de grossesse, risque élevé pour le fœtus à partir du 4 ème mois de grossesse. Transfusion sanguine : contrôle des donneurs, problème chez les toxicomanes intra-veineux. Traitement par la pénicilline + dépistage baisse des cas de syphilis Toutefois, réémergence des cas récemment : –USA –Europe de lest –France –Rôle du VIH, toxicomanie, ouverture frontières, appauvrissement des populations, changement des mœurs sexuels.

4 Syphilis Reported cases by stage of infection: United States, 1941–2003

5 Primary and secondary syphilis Rates by state: United States and outlying areas, 2003 Note: The total rate of primary and secondary syphilis for the United States and outlying areas (Guam, Puerto Rico and Virgin Islands) was 2.5 per 100,000 population. The Healthy People 2010 target is 0.2 case per 100,000 population.

6 Primary and secondary syphilis Age- and sex- specific rates: United States, 2003

7 Syphilis Réseau de sites volontaires : DAV, consultations hospitalières, médecins de ville Depuis 2000 Cas : syphilis « infectieuse » (primaire, secondaire, latente précoce < 1an) 2 Questionnaires : clinique et comportemental INSTITUT DE VEILLE SANITAIRE INSTITUT DE VEILLE SANITAIRE

8 Syphilis Hommes : 96% - Femmes : 4% Homosexuels masculins : 84% Age moyen : 36.5 ans Fellation non protégée : pratique à lorigine de la contamination (55%) Co-infection VIH : 61% en 2000 à 42% en 2003 et 2004 INSTITUT DE VEILLE SANITAIRE INSTITUT DE VEILLE SANITAIRE

9 Nombre de cas de syphilis par stade et par an, France, 2000 – 2003 INSTITUT DE VEILLE SANITAIRE INSTITUT DE VEILLE SANITAIRE

10 Syphilis (données partielles nov04) Nombre de cas de syphilis par région et par semestre, er semestre 2004 INSTITUT DE VEILLE SANITAIRE INSTITUT DE VEILLE SANITAIRE

11 Schéma pathogénique de la syphilis non traitée Période dincubation silencieuse : environ 3 semaines Phase de syphilis primaire : environ 1 mois –Chancre indolore, adénopathie satellite, riche en tréponèmes –Phase dapparition des anticorps sériques Phase de syphilis secondaire : 6 mois à 1 an –Phase de dissémination à tous les tissus –Poussées successives dérosions des muqueuses et déruptions cutanées, avec adénopathies et signes généraux Phase de syphilis latente asymptomatique : environ 2 à 30 ans –Persistance des tréponèmes dans les phagocytes Phase de syphilis tertiaire ou syphilis tardive symptomatique –Lésions cutanées, viscérales, cardio-vasculaires ou neurologiques chez 1/3 des patients

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25 Treponema pallidum Famille des spirochaetaceae, genre Borrelia, Leptospira et Treponema 4 sous-espèces de T.pallidum différentes pathologies –T. pallidum subsp. pallidum syphilis –T. pallidum subsp. pertenue pian –T. pallidum subsp. endemicum bejel –T. pallidum subsp. carateum pinta ou carate (tréponématoses endémiques) Aucun tréponème na été cultivé in vitro

26 Tréponématoses endémiques Pian, Pinta, Bejel lésions cutanées transmises dès lenfance par contage direct. –Pian : régions inter-tropicales –Bejel : régions désertiques dAfrique et du Moyen Orient –Pinta ou Carate : méso Amérique et Amérique du Sud Aucune technique de diagnostic direct ou indirect ne permet de distinguer ces agents pathogènes.

27 Structure antigénique de T. pallidum Très complexe alors que le génome est très petit (900 Kbp). Grande diversité dans la réponse anticorps mise en évidence par des tests différents. Membrane denveloppe peu immunogène Lipoprotéine de lespace périplasmique très immunogène (Lp 47 Kd) Endoflagelles immunogènes Peptidoglycane peu immunogène Membrane cytoplasmique contient le cardiolipide (haptène de Wasserman)

28 Diagnostic biologique direct Prélèvement des lésions primaires et secondaires (chancre, ganglions, plaques muqueuses) –Sérosité qui sourd de lulcération –Prélèvement entre lame et lamelle –Microscope au fond noir : fine bactérie spiralée régulièrement dune longueur de 5 à 20 µm, mobilité en spirale, flexion, en avant. –IFI : intéressant si la lecture est différée –Imprégnation argentique de Fontana Tribondeau : peut déformer les spires

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34 Détection génomique de T. pallidum PCR +++ car T. pallidum non cultivable. –Dans échantillons biologiques ou T. pallidum sont peu nombreux –Syphilis congénitale –Neurosyphilis Situations où linterprétation sérologique peut être difficile. Situations où linterprétation sérologique peut être difficile. Liquide amniotique : PCR sensible et spécifique LCR : résultats inconstants –Faux négatifs par présence dinhibiteurs –Persistance du génome longtemps après la fin du traitement chez les sujets guéris PCR ne permet pas de différencier T. pallidum de T. pertenue. Technique lourde.

35 Diagnostic sérologique Très important car tréponèmes non cultivables in vitro. 2 types de réactions selon la matière de lantigène utilisé. –Tests à antigènes non tréponémique (cardiolipides) –Tests à antigènes tréponémique détectant des anticorps spécifiques des tréponèmes

36 Réactions à antigènes non spécifiques VDRL ou RPR Antigène : suspension de microcristaux de cholestérol –+ cardiolipide –+- charbon ou latex coloré Principe : en présence danticorps anticardiolipides agglutination de lantigène visible à lœil nu ou au microscope –Dilution de dépistage : pure –Si positif : dilution de 2 en 2 Intérêt : –Anticorps se positivant précocément en primo-infection –Bon indicateur defficacité du traitement Inconvénient : –Peu spécifique –Phénomène de zone

37 Réactions à antigènes tréponémiques THPA FTA abs EIA TPI ou test de Nelson Western blot

38 Les réactions à antigènes tréponémiques de dépistage TPHA ou hémagglutination passive : –Lysat de T. pallidum absorbés sur hématies –Intérêt : peu coûteux, simple, spécifique –Inconvénients : Se positive plus tardivement Titres peu influencés par lantibiothérapie Rares faux positifs FTA-abs ou immunofluorescence indirecte : –Suspension de T. pallidum fixés sur lame –Sérum dilué et absorbé auparavant dans extraits de tréponèmes de Reiter, testicules de lapins, hématies de mouton –Intérêt : réaction la plus précoce et la plus sensible –Inconvénients : Diffcile à standardiser, lecture délicate Titres peu influencés par lantibiothérapie EIA : –Extraits antigéniques natifs ou recombinants –Intérêt : automatisable –Limites : qualitatif uniquement actuellement

39 TPHA Antigène : lysat de T. pallidum souche Nichols absorbés sur des hématies (aviaires, humaines, ovines) Principe : la présence danticorps spécifiques hémagglutination des hématies qui forment un voile dagglutination à la surface des cupules réactionnelles –Dilution de dépistage : 1/80 –Si positif, dilution de 2 en 2 Intérêt : test facile, peu coûteux, automatisable, spécifique Limites : –se positive plus tardivement que le FTA-abs en début dinfection –peu influencé par le traitement –Quelques faux positifs

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41 Immunofluorescence indirecte (FTA-abs) Antigène : suspension standardisée de T. pallidum fixés sur une lame Principe : le sérum est dilué au 1/5 dans un sorbent (ultrasonat de tréponèmes de Reiter, globules rouges de mouton et de bœuf, extrait de testicules de lapin). La fixation des anticorps aux tréponèmes est révélée à laide danticorps marqués à la fluoresceine –Dilution de départ : 1/200 –Si positif, titrage par dilution de 2 en 2 Intérêt : peut confirmer précocement une syphilis débutante. Limites : –peu adapté aux grandes séries –Faux positif (maladies auto-immunes et infectieuses) –Personnel expérimenté –Matériel

42 EIA Antigènes : natifs ou recombinants fixés sur plaque à microtitration Principe : les anticorps fixés sont révélés par les antiglobulines marquées et révélés par substrat chromogène Intérêts : –Détecte les IgG et/ou les IgM –Lecture spectrophotométrique objective, automatisable –Dépistage de grande séries (CTS) Limites : –Tests uniquement qualitatifs –Ne dispense pas actuellement de réaliser les autres tests si positif

43 Les réactions tréponémiques de confirmation Détection des IgM spécifiques Western-blot Test de Nelson

44 Détection des IgM spécifiques 4 techniques : –FTA-abs IgM : Sur sérum total Sur fraction 19S IgM après ultracentrifugation –SPHA –EIA IgM Intérêt : 1.IgM sont les premiers anticorps à apparaître en cas de primo- infection 2.IgM positives = syphilis active 3.Chez le nouveau-né : IgM+ affirme un syphilis congénitale 4.Chez le patient traité : la persistance dIgM fait craindre un échec thérapeutique et indique la nécessité dun nouveau traitement

45 Western blot ou immuno-empreintes sur tréponèmes Il existe plus de 22 antigènes tréponémiques polypeptidiques réagissant avec les sérums de sujets syphilitiques Mais de nombreux essais ont montré que 3 protéines étaient suffisantes et essentielles pour affirmer une positivité : –La lipoprotéine membranaire majeure de 47 kD –Deux protéines membranaires de 17 kD et de 14.5 kD Intérêt : –Réactifs commercialisés prêts à lemploi –Permettant de détecter des IgG et les IgM en 3h –Réalisation facile –Très sensible et très spécifique Inconvénient –Utilisation de tréponèmes pâles provenant de testicules de lapin

46 Test de Nelson Antigène : tréponème vivant, mobile, en milieu de survie Principe : mettre en présence une suspension de T. pallidum vivants, le sérum du patient décomplémenté et du complément de cobaye si anticorps spécifiques, activation du complément qui lyse la membrane externe du tréponème immobilisation en comparaison à un témoin sans complément. –Dépistage : sérum au 1/10 = % dimmobilisation –Si positif : dilution de 2 en 2 Intérêt : –test spécifique longtemps condidéré comme le test de référence –Se positive en fin de phase primaire –Titres élevés en phase secondaire –Titres faibles dans les phases latentes et tardives Limites : –Très lourd –Entretien de la souche –Lecture subjective

47 Cinétique des anticorps dans la syphilis non traitée FTA IgM : 25 à 30 jours après contamination FTA IgG ou EIA en deuxième position Suivi du VDRL Puis du TPHA Puis enfin du Test de Nelson : 50 à 60 jours Les anticorps augmentent titres élevés en phase secondaire (6 à 18 mois dévolution) Chute des anticorps en phase de latence avec VDRL +- Phase III, réascension des anticorps à taux variables

48 Cinétique des anticorps dans la syphilis traitée Si traitement au début du chancre : les anticorps peuvent rester négatifs Au stade de syphilis primaire, chute rapide des anticorps et disparition en 3 à 6 mois Si traitement plus tardif, chute des IgM et du VDRL, mais persistance dune cicatrice sérologique en TPHA et +- FTA

49 Conclusion La syphilis reste un problème mondial de Santé Publique, malgré les disparités de sa prévalence selon les pays et selon la qualité de la prise en charge médicale T. pallidum reste sensible à la pénicilline, ce qui permettrait denvisager son éradication, ce dautant que le seul réservoir connu est humain Limpossibilité de cultiver T. pallidum reste un problème majeur à la compréhension de la pathogénèse de la maladie et au diagnostic Le diagnostic sérologique classique associant VDRL- TPHA reste dun grand intérêt en pratique courante La confirmation par le FTA-abs et/ou par limmunoblot associés à la détection des IgM est dune très grande sensibilité.


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