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TECHNIQUES DE CULTURE CELLULAIRE. Année 2006-2007 Équipe pédagogique du Lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET2 Techniques de culture cellulaire Les cellules.

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1 TECHNIQUES DE CULTURE CELLULAIRE

2 Année Équipe pédagogique du Lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET2 Techniques de culture cellulaire Les cellules Les cellules Les milieux de culture Les milieux de culture Les contenants Les contenants Lenvironnement Lenvironnement Lentretien Lentretien

3 Année Équipe pédagogique du Lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET3 Les cellules Cellules normales Cellules normales À nombre de repiquages limité À nombre de repiquages limité Obtention Obtention À partir dun prélèvement tissulaire : avec ou sans dissociation À partir dun prélèvement tissulaire : avec ou sans dissociation Dissociation des liaisons fortes entre cellules Dissociation des liaisons fortes entre cellules Mécanique : broyage, vortexage … Mécanique : broyage, vortexage … Enzymatique essentiellement Enzymatique essentiellement Mise en culture : culture primaire Mise en culture : culture primaire Repiquage ou « passage » : culture secondaire Repiquage ou « passage » : culture secondaire

4 Année Équipe pédagogique du Lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET4 Les cellules Cellules transformées (ou éventuellement embryonnaires) Cellules transformées (ou éventuellement embryonnaires) À nombre de passages illimité donnant une lignée continue À nombre de passages illimité donnant une lignée continue les plus utilisées en culture cellulaire et virologie médicale : Cellules Vero, cellules rénales de singe vert africain (Cercopithecus aethiops) les plus utilisées en culture cellulaire et virologie médicale : Cellules Vero, cellules rénales de singe vert africain (Cercopithecus aethiops) Aspect de fibroblaste : fusiforme Aspect de fibroblaste : fusiforme Adhérant rapidement au support de verre ou plastique grâce aux ions Ca 2+ ou Mg 2+. Adhérant rapidement au support de verre ou plastique grâce aux ions Ca 2+ ou Mg 2+. Autres cellules Autres cellules Cellules tumorales : Cellules tumorales : HeLa (tumeur utérine) ; HeLa (tumeur utérine) ; KB (carcinome oral humain) KB (carcinome oral humain) Cellules embryonnaires : Cellules embryonnaires : MRC-5 (poumon de foetus humain) ; MRC-5 (poumon de foetus humain) ; 3T3 (embryon de souris) 3T3 (embryon de souris)

5 Année Équipe pédagogique du Lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET5 Les cellules Cellules non transformées Mort programmée = apoptose Log n cellules Temps Culture primaire Culture secondaire Cellules transformées Lignée continue Premier passageDeuxième passage

6 Année Équipe pédagogique du Lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET6 Les cellules Division : environ 25 à 30 heures Division : environ 25 à 30 heures Si cellules adhérentes Si cellules adhérentes Formation dun tapis (« à confluence ») pour une densité 10 5 / cm 2 Formation dun tapis (« à confluence ») pour une densité 10 5 / cm 2 Puis détachement et mort Puis détachement et mort Nécessité dun changement de milieu Nécessité dun changement de milieu tous les 2 à 3 jours tous les 2 à 3 jours

7 Année Équipe pédagogique du Lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET7 Les milieux de culture Exigences cellulaires minimales Exigences cellulaires minimales eau eau ions minéraux donnant une osmolarité identique à celle du sérum physiologique ions minéraux donnant une osmolarité identique à celle du sérum physiologique source de carbone et d'énergie (glucose par exemple) source de carbone et d'énergie (glucose par exemple) source d'azote : acides aminés source d'azote : acides aminés source dacides gras source dacides gras pH constant 7,4 (indicateur de pH : rouge de phénol) grâce un système tampon CO 2 /HCO 3 - ou phosphates. pH constant 7,4 (indicateur de pH : rouge de phénol) grâce un système tampon CO 2 /HCO 3 - ou phosphates. Base commune (milieux Hanks, Earl, PBS, Gey) : Base commune (milieux Hanks, Earl, PBS, Gey) : Sels minéraux : NaCl, KCl, CaCl 2, MgCl 2, NaH 2 PO 4 … Sels minéraux : NaCl, KCl, CaCl 2, MgCl 2, NaH 2 PO 4 … Sucre : glucose Sucre : glucose Compléments variables selon les milieux (RPMI, MEM, DMEM…) Compléments variables selon les milieux (RPMI, MEM, DMEM…) Acides aminés Acides aminés Vitamines et cofacteurs Vitamines et cofacteurs Bases azotées, ribose et désoxyribose Bases azotées, ribose et désoxyribose

8 Année Équipe pédagogique du Lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET8 Les milieux de culture Compléments à ajouter extemporanément : Compléments à ajouter extemporanément : Mélanges dantibiotiques au taux final de 1 % Mélanges dantibiotiques au taux final de 1 % Pénicilline G, Pénicilline G, Streptomycine, Streptomycine, Amphotéricine B (antifongique)… Amphotéricine B (antifongique)… Glutamine à 1% (acide aminé instable) Glutamine à 1% (acide aminé instable) Sérum de veau fœtal (S.V.F. ou F.C.S. Fœtal Calf Serum) entre 1,5 et 10 % Sérum de veau fœtal (S.V.F. ou F.C.S. Fœtal Calf Serum) entre 1,5 et 10 % prélevé stérilement et décomplémenté prélevé stérilement et décomplémenté apportant apportant facteurs de croissance cellulaire facteurs de croissance cellulaire EGF (facteur de croissance épidermique), EGF (facteur de croissance épidermique), FGF (facteur de croissance fibroblastique) FGF (facteur de croissance fibroblastique) PDGF (facteur de croissance dérivé des plaquettes) PDGF (facteur de croissance dérivé des plaquettes) Facteurs de différenciation comme fibronectine (ancrage des cellules). Facteurs de différenciation comme fibronectine (ancrage des cellules). Inhibiteurs comme lalpha1 antitrypsine (neutralisation de laction enzymatique de la trypsine) Inhibiteurs comme lalpha1 antitrypsine (neutralisation de laction enzymatique de la trypsine)

9 Année Équipe pédagogique du Lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET9 Les contenants Flacons Flacons En polystyrène optiquement clair stérile En polystyrène optiquement clair stérile Traités ou non pour adhérence Traités ou non pour adhérence De contenance et surface variable par ex : De contenance et surface variable par ex : 25 cm 2 contenance totale 60 mL / vol 5 mL 25 cm 2 contenance totale 60 mL / vol 5 mL 75 cm 2 contenance totale 250 mL / vol 10 mL 75 cm 2 contenance totale 250 mL / vol 10 mL 150 cm 2 contenance totale 60 mL / vol 20 mL 150 cm 2 contenance totale 60 mL / vol 20 mL Plaques multipuits Plaques multipuits En polystyrène optiquement clair stérile En polystyrène optiquement clair stérile Traités ou non pour adhérence Traités ou non pour adhérence À fond plat et couvercle À fond plat et couvercle Nombre de puits et contenance variable Nombre de puits et contenance variable 6, 12, 24, 48, 96 6, 12, 24, 48, 96 Boites Boites En polystyrène optiquement clair stérile En polystyrène optiquement clair stérile Traités ou non pour adhérence Traités ou non pour adhérence Diamètre allant de 35 à 150 mm Diamètre allant de 35 à 150 mm

10 Année Équipe pédagogique du Lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET10 Lenvironnement durant lincubation Respectant certains paramètres physico-chimiques nécessaires à la culture cellulaire la température : 37 °C la température : 37 °C l'hygrométrie : 84 à 85 % dhumidité l'hygrométrie : 84 à 85 % dhumidité le pH 7,4 maintenu grâce aux systèmes tampon le pH 7,4 maintenu grâce aux systèmes tampon du milieu du milieu renforcés par à latmosphère enrichie à 5% de CO 2 (système tampon avec HCO 3 - ) renforcés par à latmosphère enrichie à 5% de CO 2 (système tampon avec HCO 3 - )

11 Année Équipe pédagogique du Lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET11 Lincubateur à CO 2 5 %37°C Incubateur fermé avec Voyants de Pression en CO 2 et température Bonbonne danhydride carbonique Ses manomètres de pression Son système dinjection Double porte avec verrouillage Bac deau stérilisée pour maintien dun taux dhumidité suffisant Clayettes perforées pour circulation dair

12 Année Équipe pédagogique du Lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET12 Lenvironnement durant le repiquage Respectant la stérilité Sensibilité des cellules aux infections Bactériennes (en particulier les mycoplasmes), Bactériennes (en particulier les mycoplasmes), Fongiques, Fongiques, Virales. Virales. Utilisation de façon adéquate dune enceinte à atmosphère stérile : PSM Poste de Sécurité Microbiologique PSM Poste de Sécurité Microbiologique Indicateur de pH : Rouge de phénol rose à pH 7,4 rouge si alcalinisation (infection fongique) jaune si acidification (contamination bactérienne ou mort cellulaire)

13 Année Équipe pédagogique du Lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET13 Le PSM Enceinte une paillasse inox (parfois perforée) une paillasse inox (parfois perforée) des grilles daspiration des grilles daspiration un écran transparent un écran transparent un ventilateur un ventilateur créant une aspiration dair par les grilles daspiration créant une aspiration dair par les grilles daspiration une zone de filtration dair par deux filtres HEPA une zone de filtration dair par deux filtres HEPA retenant toute particule de diamètre >0,3 µm retenant toute particule de diamètre >0,3 µm redistribuant lair filtré redistribuant lair filtré dans lenceinte de travail 65 % dair stérile dans lenceinte de travail 65 % dair stérile dans latmosphère les 35% restants dans latmosphère les 35% restants 35% 65% 100%

14 Année Équipe pédagogique du Lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET14 Lentretien Suivi de la culture cellulaire Aspect macroscopique Aspect macroscopique Observation du milieu de culture limpide et rose pouvant devenir trouble et/ou rouge ou jaune Observation du milieu de culture limpide et rose pouvant devenir trouble et/ou rouge ou jaune Au microscope inversé Au microscope inversé sous la platine : les objectifs sous la platine : les objectifs au dessus de la platine : léclairage au dessus de la platine : léclairage avec contraste de phase : meilleure visualisation des prolongements cytoplasmiques, organites et vacuoles avec contraste de phase : meilleure visualisation des prolongements cytoplasmiques, organites et vacuoles Vacuolisation et présence de cellules arrondies en suspension = souffrance et perte dadhésion Vacuolisation et présence de cellules arrondies en suspension = souffrance et perte dadhésion Nécessité de changer le milieu tous les 2 ou 3 jours Nécessité de changer le milieu tous les 2 ou 3 jours

15 Année Équipe pédagogique du Lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET15 Lentretien Microscope inversé Microscope inversé sous la platine : les objectifs au dessus de la platine : léclairage avec contraste de phase

16 Année Équipe pédagogique du Lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET16 Lentretien Installation du Poste (PSM) Nettoyage des mains et avant bras Nettoyage des mains et avant bras Désinfection à lalcool Désinfection à lalcool du plan de travail du plan de travail de tout le matériel nécessaire de tout le matériel nécessaire Pipettes stériles, portoirs, auxiliaire de pipetage ou pipettes automatiques avec filtres et cônes stériles, tubes stériles… Pipettes stériles, portoirs, auxiliaire de pipetage ou pipettes automatiques avec filtres et cônes stériles, tubes stériles… de tous les récipients contenant les réactifs stériles de tous les récipients contenant les réactifs stériles Milieu complémenté (ou réactifs pour le constituer) Milieu complémenté (ou réactifs pour le constituer) Trypsine Trypsine

17 Année Équipe pédagogique du Lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET17 Lentretien Lavage des mains et des avant-bras Désinfection du matériel Installation sous PSM après désinfection du plan

18 Année Équipe pédagogique du Lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET18 Lentretien Élimination du milieu ancien Rinçage en tampon sans Ca 2+ Ajout de trypsine

19 Année Équipe pédagogique du Lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET19 Lentretien Action de la trypsine surveillée au microscope

20 Année Équipe pédagogique du Lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET20 Lentretien Inaction de lactivité enzymatique de ta trypsine par ajout de milieu complémenté Prélèvement dune fraction de la suspension pour dénombrement après une série daspirations refoulements prolongée pour détacher les cellules

21 Année Équipe pédagogique du Lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET21 Lentretien Dénombrement en présence dun colorant pour estimation de la viabilité cellulaire : Par exemple, Bleu de Funk (ou Trypan) exclus des cellules vivantes et pénétrant dans les cellules mortes Calcul du volume de suspension cellulaire (cellules viables) à introduire dans le milieu neuf pour une nouvelle incubation de 2 à 3 jours


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