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ADN fœtal dans le sang maternel > J.M. COSTA Laboratoire Cerba Colloque ATC Aix-en-Provence 20 Septembre 2010.

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1 ADN fœtal dans le sang maternel > J.M. COSTA Laboratoire Cerba Colloque ATC Aix-en-Provence 20 Septembre 2010

2 Diagnostic prénatal in utero en France : rappels Principales indications Anomalies chromosomiques Maladies et caractéristiques génétiques2.881 –Mucoviscidose –Hémoglobinopathies –Amyotrophie spinale –Achondroplasie… Foetopathies infectieuses6.443 –Toxoplasmose –Cytomégalovirus, parvovirus B19, varicelle… Données Agence de la Biomédecine année 2007

3 Diagnostic des anomalies chromosomiques : Indication Age maternel ( 38 ans) Marqueurs sériques Soit de 345 à 690 pertes fœtales pour 895 trisomies 21 détectées Diagnostic prénatal in utero en France : rappels Données Agence de la Biomédecine année 2007

4 Les acides nucléiques circulants ou cellules fœtales ? Diagnostic prénatal à partir du sang maternel

5 ADN fœtal plasmatique Physiopathologie Origine cellulaire: les cellules trophoblastiques Apparition précoce dans la circulation maternelle 5-6SA Augmentation de la concentration tout au long de la grossesse Disparition rapide (< 48 h) après accouchement (1/2 vie 16 min) Pas de persistance après grossesse

6 ADN fœtal plasmatique Méthode détude de concept simple Recueil du plasma/sérum Extraction des acides nucléiques Analyse par biologie moléculaire

7 ADN fœtal plasmatique Difficultés et limites Analyse moléculaire Séquençage… MLPA, QF-PCR… Caryotype moléculaire (CGH-array, SNP-array)

8 ADN fœtal plasmatique Difficultés et limites danalyse Ne représente que 3 à 6% de lADN plasmatique Quantité faible au 1 er trimestre : Geq/ml Analyse restreinte à la détection de séquences absentes du génome maternel

9 Analyse de lADN fœtal plasmatique Recherche de séquences absentes du génome maternel XY Détermination du sexe fœtal : Recherche de séquences dérivées du chromosome Y (gèneSRY)

10 Sérum positif (x4) Sérum négatif (x4) Diagnostic de sexe fœtal par analyse de lADN fœtal circulant

11 Détermination du sexe foetal Intérêts –Maladies génétiques liées à lX –Eviter un geste invasif (CVS) chez les patientes conductrices qui portent un fœtus de sexe féminin (ne présentant aucun risque) –Hyperplasie congénitales des surrénales (déficit en 21-hydroxylase) –Eviter le recours à un traitement corticoïde chez les patientes qui portent un foetus de sexe masculin (traitement inutile) –Ambiguïtés sexuelles échographiques, discordances caryotypes/échographie –Aide à la prise en charge.

12 Analyse de lADN fœtal plasmatique Recherche de séquences absentes du génome maternel RHD+ Génotypage RHD fœtal : séquences dérivées du gène RHD RHD-

13 Analyse de lADN fœtal circulant: application au génotypage RHD Les bases moléculaires du système rhésus Gène RHD Gène RHCE 98 % dhomologie au niveau nucléotidique 92 % dhomologie au niveau protéique 3UTR

14 Analyse de lADN fœtal circulant: application au génotypage RHD Les bases moléculaires du phénotype RhD-négatif Phénotype RhD-positif 85 % Phénotype RhD-négatif 15 % + + del + 43 % 42 %

15 Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel: principe Génome paternel RhD-positif Sang maternel Fœtus RhD-négatif Génome maternel + Génome foetal Fœtus RhD-positif Détection par amplification génique (PCR en temps réel) de séquences nucléotidiques (dorigine paternelle) dérivées du gène RHD Génome maternel + Génome foetal Ex5 Ex7 Ex10

16 Génotypage RHD fœtal non invasif Indications –Les patientes RhD-négatives allo-immunisées Eviter un geste invasif qui risque de réactiver limmunisation –Les patientes RhD-négatives devant subir un geste invasif Eviter une prophylaxie anti-D inutile Mise en place dune prophylaxie immédiate Intérêt: environ 30% des fœtus sont RhD-négatifs o Limiter lexposition à des produits dérivés du sang o Limiter lutilisation des immunoglobulines (stocks limités) o Augmente la pertinence de la prophylaxie (Jones et al, BJOG 2004;111: ). Pour éviter 1 cas dallo-immunisation, il faut traiter: –278 femmes en labsence de génotypage –166 femmes si le génotype fœtal RHD est connu positif

17 Diagnostic prénatal non invasif des maladies monogéniques (ou caractéristique génétique) ? Un défi technologique majeur-1 Délétion/insertion, réarrangement complexe and expansion de triplets : IMPOSSIBLE (?) Détection de mutation ponctuelle: ENVISAGEABLE … si développement de techniques sensible de détection de séquences minoritaires Real-time PCR (PNA, allele-specific…) PCR-dHPLC PCR-High Resolution Melting PCR et primer extension (MALDI-TOF)….

18 1% 0% 2.5% 5% Détection dune population minoritaire dallèle muté: exemple de la PCR-HRM Proportion de lallèle muté au sein dun background « sauvage »

19 Analyse de lADN fœtal plasmatique Recherche de mutations ponctuelles chez le foetus Mutation de novo : achondroplasie Recherche de la mutation G380R du gène FGFR3 Ce qui va changer ? (validation clinique en cours) Complément à lanalyse échographique Ce qui pourrait se faire ? Hypochondroplasie Nanisme thanatophore Syndrome dApert

20 Analyse de lADN fœtal plasmatique Recherche de mutations ponctuelles chez le foetus SNP paternel : génotypage KEL (K1) Recherche du variant Thr193Met du gène KEL Ce qui va changer ? (validation clinique en cours) Plus de recours à lamniocentèse chez les patientes allo- immunisées pour évaluation fœtale Ce qui pourrait se faire ? Génotypage plaquettaire (HPA1…) Diagnostic des maladies autosomiques dominantes (paternelle) Test de paternité K1K2

21 Diagnostic prénatal non invasif des anomalies chromosomiques (trisomie 21) ? Un défi technologique majeur-2 Remaniements chromosomiques complexes: IMPOSSIBLE (?) Aneuploïdies (trisomie 13, 18 et/ou 21) : POSSIBLE … par quantification du nombre de chromosomes du fœtus : Marqueurs non spécifiques Marqueurs spécifiques du foetus: ARN (fœtaux) placentaires ou marqueurs épigénétiques

22 Quantification de marqueurs NON-SPECIFIQUES Chr21 mère Foetus EuploïdeFoetus T21 Chr21 foetus ADN fœtal plasmatique et trisomie

23 Dosage chromosomique relatif (RCD) par Digital PCR ADN fœtal plasmatique et trisomie 21

24 Quantification par « massively parallel sequencing » bridge amplification by synthesis Massive parallel sequencing PCR emulsion by ligation Single molecule amplification ADN fœtal plasmatique et trisomie chromosomesreads

25 15 patientes (terme médian: 14 semaines) Tous les cas (9) correctement identifiés Quantification par « massively parallel sequencing » 18 patientes (terme médian: 18 semaines) Tous les cas (9) correctement identifiés ADN fœtal plasmatique et trisomie 21

26 Quantification par « massively parallel sequencing » Avantages Démonstration pour la détection des trisomies 13, 18 et 21 Approche indépendante de polymorphismes Inconvénients Coût et quantité de données générées (stockage) En létat actuel, formats inadaptés à un haut débit ADN fœtal plasmatique et trisomie 21

27 Chr21 ADN/ARN fœtal plasmatique et trisomie Foetus euploïdeFoetus T21 Quantification marqueurs fœtaux SPÉCIFIQUES: ARNs placentaires

28 ARN fœtal circulant et trisomie CGGGATAAATATCGACTC Da CGGGATAAATATCGACTC Da A C T CGGGATAAATATCGACTC Da CGGGATAAATATCGACTC Da C MassARRAY ® (Maldi-Tof) Dosage chromosomique relatif (RCD) par ratios de SNPs

29 ARN fœtal circulant et trisomie Sensibilité: 90 % (valeur prédictive négative 96,5 %) 57 patientes fœtus à caryotype normal (mean gestation 13.0 weeks) 10 patientes fœtus trisomie 21 (mean gestation 14.7 weeks) Ratio Dosage chromosomique relatif (RCD) par ratios de SNPs

30 ChrRef ADN fœtal plasmatique et trisomie Foetus euploïdeFoetus T21 Quantification marqueurs fœtaux SPÉCIFIQUES: ADN hyperméthylé Chr21

31 Ratio de HLCS /ZFY ADNs hyperméthylés 29 patientes (1er, 2 nd and 3ème trimestre) Tous les cas (5) correctement identifiés Quantification par dosage chromosomique relatif ADN fœtal plasmatique et trisomie 21

32 Aspects règlementaires Lanalyse de lADN fœtal circulant est un acte de diagnostic prénatal Laboratoires : Autorisation de diagnostic prénatal par lARH Praticiens : Agrément par lAgence de la Biomédecine Déclaration annuelle des activités diagnostiques

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