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CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 1 CHMI 2227F Biochimie I Enzymes: - Cinétique.

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1 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D. 1 CHMI 2227F Biochimie I Enzymes: - Cinétique

2 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.2 Réactions enzymatiques Enzyme (chacun = 1 µmol) Substrat (chacun = 1 µmol) Ce sont les seules concentrations que lon connait pcq nous préparons lexpérience. X min Produit

3 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.3 Réactions enzymatiques Comment mesure-t-on lactivité enymatique? 1. Détection du produit: pNA = para-nitroaniline Absorbe à 405 nm H 3 + N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-OH O OOO CH 2 COO - CH 2 COO - CH CH 3 H3CH3C CH 2 COO - NO 2 H2NH2N pNA (jaune) H 3 + N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH- O OOO CH 2 COO - CH 2 COO - CH CH 3 H3CH3C CH 2 COO - NO 2 DEVD-pNA (incolore) DEVD (incolore) Caspase 3 (protéase hydrolase) Mesure laugmentation de A 405nm

4 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.4 Réactions enzymatiques Comment mesure-t-on lactivité enymatique? 2. Accumulation/utilisation dun cofacteur: NADH = absorbe fortement à 340 nm ( = 6.3 molL -1 cm -1 ) NAD+ = nabsorbe pas à 340 nm Mesure laugmentation de A 340nm Mesure la diminution de A 340nm Lactate dehydrogenase

5 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.5 Réactions enzymatiques Comment mesure-t-on lactivité enymatique? 3. Réactions enzymatiques couplées: Très utiles lorsque ni le substrat/produit/cofacteur ne peut être facilement détecté; Glutaminase + NH ière réaction Mesure laugmentation de A340nm Glutamate Dehydrogenase + NAD + + NADH +H + 2 ième réaction + NH H 2 O Peut être détecté par HPLC (peu pratique)

6 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.6 Réactions enzymatiques 1 min 3 µmol / min Vitesse de la réaction 15 µmol S vs 1 µmol E Temps [Produit] Pente = vitesse initiale = v 0 = [P] / time 2 min 3 µmol / min 4 min <3 µmol / min

7 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.7 Réactions enzymatiques Temps [Produit] v 0 est proportionnel à [E] 1µmol E 2µmol E 3µmol E 1 min 3 µmol / min 15 µmol S vs 1 µmol E 1 min 6 µmol / min 15 µmol S vs 2 µmol E 1 min 9 µmol / min 15 µmol S vs 3 µmol E

8 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.8 Réactions enzymatiques 1 min 2 µmol / min 1 µmol / min 1 min 3 µmol / min 1 min [Substrat] v0v0 Vitesse maximale = Vmax Vmax ½ Vmax E saturé par S

9 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.9 Réactions enzymatiques

10 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.10 Équation de Michaelis-Menten [Substrat] v0v0 Vitesse maximale = Vmax Vmax ½ Vmax E + S ES E + P k2k2 k1k1 k- 1 RAPIDELENT v o = Vmax [S] Km + [S]

11 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.11 Équation de Michaelis-Menten [Substrat] v0v0 Vmax ½ Vmax Km1 Km2 E2 E1

12 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.12 Km

13 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.13 Turnover number E + S ES E + P k2k2 k1k1 K- 1 RAPIDELENT

14 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.14 Mesure de Km et Vmax [Substrate] v0v0 Vmax ½ Vmax Km

15 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.15 Mesure de Km et Vmax 1/v o 1/[S] 1/V max -1/Km Graphe de Lineweaver-Burk 1vo1vo = Km x Vmax [S] Vmax


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