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Examens complémentaires en hématologie hématologie cellulaire En pratique hémostase.

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1 Examens complémentaires en hématologie hématologie cellulaire En pratique hémostase

2 Examens complémentaires en hématologie hémogramme numération des réticulocytes immunophénotypage des cell. Sanguines myélogramme/biopsie médullaire caryotype/réarrangement des gènes des Ig et du TCR /recherche de translocations en biologie moléculaire adénogramme/biopsie ganglionnnaire fer sérique, transferrine et ferritine électrophorèse de lHb, test de Coombs, dosages vitaminiques méthodes isotopiques in vivo

3 Examens complémentaires en hématologie Quand ? bilan systématique -pré-opératoire -1ère hospitalisation hémogramme Comment? prélèvement: veineux, jeun non obligatoire ne pas prélever dans tubulure de perfusion (dilution), à distance des intra-lipides (interférence avec leucocytes) à adresser à t°ambiante en – de 6H Bilan orienté- pâleur, dyspnée, amaigrissement, fièvre inexpliquée, adénopathies, VS… Conditions de réponse: fonction de lurgence clinique, distance du laboratoire, horaire des ramassages… 20 mn à 6H

4 Examens complémentaires en hématologie hémogramme Technique : automates utilisant 2 paramètres principaux comptage électronique des particules, diffraction dun rayon laser à petit et grand angles (volume, densité du contenu de la cellule GR hypo/hyperchromes), +/- techniques cytochimiques (évaluation du contenu en peroxydases des granuleux et monocytes) +/- techniques de fluorescence (densité du noyau, contenu en ARN du cytoplasme ex lymphocytes activés) Systèmes dalarmes de + en + précises quanti/qualitatives détectant les incertitudes de lautomate les microcytes peuvent être comptés comme des plaquettes les grosses plaquettes comme des leucocytes GR décomptés comme leucocytes ds certaines conditions gouttelettes lipidiques décomptées comme des GB

5 Examens complémentaires en hématologie valeurs automatisées -mesurées (réponse dans 1/2 journée): numération des GR, des GB et des plaquettes taux dhémoglobine volume globulaire moyen et indice de distribution (CVGR<15%) - calculées: TGMH* (Hb/nbre GR) * TCMH ou HCM mesurée particule/particule % GR hypochromes hématocrite ( GRxVGM)- CCMH (Hb/Ht) pas d intérêt clinique formule leucocytaire en valeur absolue - 5 catégories leucocytaires Gr N, Eo, B; Ly; Monocytes - détection de cellules anormales +/- fiable ss forme dalarmes hémogramme toute anomalie quantitative/qualitative détectée par lautomate génère des alarmes étude morphologique des éléments figurés sur lame réponse dans journée

6 Examens complémentaires en hématologie hémogramme étude morphologique des éléments figurés sur lame étalement automatisé ou manuel d une goutte de sang et coloration de MGG décompte de 100 leucocytes sur certains automates, détection automatisée des érythroblastes et de la myélémie morphologie des GR, détection dérythroblastes à décompter du nombre de GB si nombreux (comptés par plupart des automates comme GB) morphologie des leucocytes et détection des cellules anormales (myélémie, blastes, cellules lymphomateuses..) morphologie plaquettaire et détection déventuels agrégats plaquettaires (fausses thrombopénies)

7 Examens complémentaires en hématologie hémogramme Numération globulaire normale en fonction de l âge et du sexe HommeFemme Enfant NourrissonNouveau-né 3-12ans3 mois-1an Nombre de GR /l Hb (g/dl) VGM (fl) TGMH (pg) Hématocrite (l/l) CCMH (g/dl) Nombre de GB 10 9 /l neutrophiles éosinophiles basophiles lymphocytes monocytes Plaquettes 10 9 /l

8 Examens complémentaires en hématologie valeurs automatisées : -numération des GR -taux dhémoglobine fausses anémies par hémodilution (grossesse, splénomégalie, composant monoclonal IgM très élevé) fausses polyglobulies par hémoconcentration (grands brûlés) anémies masquées par hémoconcentration (déshydratation) -volume globulaire -TGMH calculé Anomalies des Globules rouges Anémie Hb < g/dl Polyglobulie Hb >16-18 g/dl Microcytaire <80 fl normo/macrocytaire fl Hypochrome<27pg Normochrome * TCMH ou HCM mesurée particule/particule % de GR hypochromes détection précoce dune carence en fer avant modification de la valeur moyenne globale CVGR >15% distribution anormale du volume des Gr

9 Examens complémentaires en hématologie Neutropénie en valeur absolue < 1.8 G/L ou 10 9 /l - sévère si < 1 - agranulocytose si < 0.5 (urgence diagnostique) Polynucléoses > 8 +/- myélémie (+/- importante) Anomalies leucocytaires et plaquettaires Hyperéosinophilies > 0.9 G/L ou 10 9 /l thrombopénie < 150, sévère si < 50, symptomatique si < 20 hyperplaquettose > 600 causes multiples, > 1000 SD myéloprolifératif Hyperlymphocytoses > 4 G/L ou 10 9 /l - réactionnelles - tumorales Cytologie +/- phénotype à confronter à l âge, contexte clinique (fièvre, syndrome tumoral)

10 Examens complémentaires en hématologie Numération globulaire - Rappel paramètres mesurés Nombre de GR intérêt pratique très limité VGM exprime une moyenne lhomogénéité ou lhétérogénéité de la population est exprimé par lindice de distribution (CVGR) normalement < 15% Hb mesure spectrophotométrique, peut être faussé epar opalescence du plasma ou défaut de lyse des GR paramètres calculés Ht = % de GR dans un volume de sang= GR x VGM TGMH= Hb/GR CCMH= Hb/Ht, pas dintérêt clinique, valeur de bon étalonnage de l automate, son augmentation peut témoigner de l agglutinationdes GR (ou fausse valeur HB)

11 Examens complémentaires en hématologie Numération des réticulocytes Quand ? devant anémie normo/macrocytaire Évalue la production médullaire érythroblastique et donc le caractère régénératif ou arégénératif de lanémie Comment? Détection de l ARN ribosomial des GR immatures (48H à 72H) classiquement par bleu de crésyl brillant ou bleu de méthylène avec lecture au microscope sur 1000 GR actuellement détection automatisée par produits fluorescents technique plus rapide et précise % et niveau de fluorescence Valeur si < 25 x 10 9 /l érythropoïèse défaillante (insuff médullaire primitive ou secondaire: insuff rénale, cause endocrinienne, carences vitaminiques, envahissements) si > 110 x 10 9 /l érythropoïèse augmentée (anémie régénérative : hémolyse, hémorragie aigüe)

12 Examens complémentaires en hématologie Exploration du fer Quand ? devant une anémie hypochrome microcytaire, avant traitement. pour le dosage du fer arrêt de Tt par le fer depuis 72H, prélèvement soigneux à jeun évitant lhémolyse, A Savoir causes principales des anémies hypochromes : carence martiale +++ thalassémie hétérozygotte +++ anémie inflammatoire +/- suspecter la carence en fer avant lanémie devant une hypochromie isolée, 1ère anomalie de la NF diminution des capacités physiques à leffort baisse des capacités intellectuelles moins bonne résistance aux infections si suspicion de surcharge martiale

13 Examens complémentaires en hématologie Exploration du fer Comment? Dosages -fer sérique, transferrine et/ou ferritine Dosage: fer sérique (13-20µmol/l), transferrine (2-3.8 g/l), et CTF 45-70µmol/L, ferritine ( µg/l chez homme, chez femme) Calcul du coefficient de saturation (CS) de la transferrine (N = 30%) interprétation dune hyposidérémie si carence en fer: fer sérique CTF transferrine CS ferritine si sd inflammatoire: fer sérique CTF transferrine CS N ferritine Limites ferritine: dans lyses cellulaires importantes, difficile à interpréter si association carence et sd inflammatoire - dosage de l hepcidine dans lavenir? Hormone régulant labsorption intestinale du fer et son relargage par les macrophages, hyperproduction dans lanémie inflammatoire - Récepteur soluble de la transferrine, en cas de carence en fer et non influencé par Sd inflammatoire

14 Examens complémentaires en hématologie Dosages vitaminiques Quand ? devant une anémie macrocytaire avant tout traitement et toute transfusion, après le myélogramme À savoir: Possibilité dassociation carence vitaminique/hémopathie carence vitaminique probable si VGM > 120fl. pas durgence à traiter (anémies dinstallation chronique) Comment? Dosages vitamine B12 ( pg/ml) et folates sériques (5-15ng/ml), érythrocytaires (>200 pg/ml de GR) par technique de radio-analyse Test de Coombs Quand? Devant une anémie normo/macrocytaire régénérative (réticulocytes > 120 x 10 9 /l ), pour rechercher origine auto-immune Comment? sur sang veineux;Test direct: mise en évidence danticorps fixés sur les GR du patient,en ajoutant des anticorps de lapin anti- immunoglobulines humains : si test +,agglutination des GR test indirect: recherche dAC libres dans le sérum du patient en présence dun panel de GR portant des antigènes connus, si fixation, agglutination en ajoutant du sérum de lapin anti-Ig humaines.

15 Examens complémentaires en hématologie Electrophorèse de lhémoglobine Quand ? quand on suspecte une anomalie de lhémoglobine de srtucture ou de synthèse En particulier devant une anémie hypochrome microcytaire, avec CVGR normal (si CVGR carence en fer) et fer sérique et ferritine normal ou augmenté Comment? Sang veineux, étude de la migration des hémoglobines dans un champ électrique Normales: Hb A1 prédominante, Hb A2 < 3.5%, Hb F traces

16 Examens complémentaires en hématologie masse sanguine quantification précise du volume globulaire par technique de dilution dhématies du sujet marquées au Cr51 ou Te99 du volume plasmatique par albumine marquée Méthodes isotopiques in vivo test de Schilling étude de labsorption de la vitamine B12 marquée au Co58 donnée per os,après saturation des réserves hépatiques avec B12 froide, par élimination urinaire en 48H. étude du mécanisme du défaut dabsorption par ingestion de B12 marquée par un autre isotope du Co associée à du FI indications Trancher entre polyglobulie vraie et fausse polyglobulie ( du volume plasmatique), anémie vraie et par hémo-dilution

17 Examens complémentaires en hématologie immunophénotypage Quand? Caractérisation de cellules anormales dans le sang, moëlle osseuse, ganglion, liquides…., pour préciser la filiation et le niveau de différenciation cellulaire, rechercher une clonalité B et/ou un profil spécifique dune entité donnée Comment? Mise en évidence dantigènes membranaires ou cytoplasmiques spécifiques de lignée et/ou de différenciation cellulaire, sur sang total ou suspensions cellulaires, par techniques dimmunofluorescence et lecture en cytométrie de flux ou dimmunocytochimie En pratique: technique assez longue (1 à 3H), semi-manuelle et coûteuse indications à discuter avec le biologiste (en dehors des numérations CD4/CD8) Adresser des tubes de sang sur EDTA (tubes à NFP) sur RV

18 Rapide (1 à qques H) caractérisation précise des pop. tumorales par doubles, triples et quadruples marquages profils spécifiques (entités B) phénotypes anormaux (T>>B) Quantification de marqueurs Clonalité B (restriction isotypique de lexpression des chaînes légères) Cytométrie de flux Immuno- cytochimie Faible consommation cell. Corrélation marqueur/cellule Réalisation compatible avec urgence (1H avec kits commerciaux) CD10

19 Sang total, Moëlle totale, liquides, suspensions cellulaires à partir de tissus Cytométrie de flux Immuno- cytochimie CD10 Indications préférentielles Etalements directs (adénogrammes, myélogrammes, empreintes de biopsies..) Étalements cyto-centrifugés de suspensions

20 Examens complémentaires en hématologie immunophénotypage Antigènes de la lignée T :CD2, CD3, CD5, CD4, CD8 Antigènes de la lignée B: DR, CD19, CD20, CD79, immunoglobuline Antigènes des cellules myéloïdes: CD13, CD33, myéloperoxydase Antigènes des cellules immatures : CD34, CD117 Profils phénotypiques spécifiques : Leucémie lymphoïde chronique CD19+ CD5+ CD23+ Lymphome folliculaire CD20+ CD10+ CD5- Antigènes des cellules monocytaires CD14, CD11 Antigènes des cellules érythroïdes: glycophorine A Antigènes de la lignée plaquettaire : CD41, CD42

21 Examens complémentaires en hématologie pour un diagnostic précis, rapide, économique nécessité dune synergie clinico-biologique Explorations tissulaires - Recommandations générales - donner des renseignements sur tableau clinique, antécédents familiaux et personnels, traitements éventuels - sinformer sur modalités de prélèvement - prélever avant tout traitement - ne pas hésiter à prendre contact avec le laboratoire - préciser si possible ce que vous attendez de l analyse demandée

22 Examens complémentaires en hématologie Quand? Rechercher/éliminer une hémopathie - cytopénie(s): anémie normo/macrocytaire arégénérative, neutropénie sévère, thrombopénie - hyperleucocytose, thrombocytose en dehors sd inflammatoire /infectieux - polyglobulie vraie (masse sanguine ) bilan dextension dun lymphome recherche dune métastase bilan dun composant monoclonal sérique/urinaire bilan de fièvre prolongée, baisse de lEG, VS augmentée sans cause infectieuse myélogramme

23 Examens complémentaires en hématologie myélogramme Comment ? Ponction sternale sauf intervention chir. ou irradiation complications exceptionnelles (effraction crosse aortique), crête iliaque postérieure (moins dangereux) trocard à usage unique type Mallarmé avec garde, anesthésie locale peau +/-périoste (patch dEMLA si hospitalisation, 30mn de délai, xylocaïne en injection s/c) Technique: Traverser table externe du sternum (pression douce si sujet âgé), puis aspiration intense et brève (douloureuse) de 1cc de moëlle maximum dans une seringue de 10cc Recueillir le maximum de grains et les écraser entre 2 lames, Éventuellement 2ème aspiration pour caryotype, culture de progéniteurs hématopoïétiques, myéloculture

24 Examens complémentaires en hématologie myélogramme En pratique Laisser sécher les frottis à lair, les adresser au laboratoire avec fiche de renseignements remplie soigneusement Examen des lames après coloration de May-Grünwald-Giemsa ( mn), délai moyen de réponse écrite 48H, réponse orale si urgence (pour mise en route de traitement) en 2H (après larrivée au laboratoire!) Examens complémentaires (décidés par le biologiste) cytochimiques Présence et répartition du fer (coloration de Perls) recherche denzymes utiles au diagnostic des hémopathies Immunocytochimiques mise en évidence dantigènes de surface/cytoplasmiques pour caractériser des cellules métastatiques/blastiques/lymphoïdes anormales Limites du myélogramme: moëlle hypoplasique ou avec fibrose Pas de contre-indication

25 Examens complémentaires en hématologie Biopsie de moëlle Quand? En deuxième ligne après réalisation du myélogramme sauf - bilan dextension dun lymphome ou dun carcinome, - si suspicion de myélofibrose à lhémogramme (hématies en poire, érythroblasto-myélémie) Comment? - Asepsie préparation morphine + patch dEMLA + AL à la xylocaïne -Prélèvement dun cylindre osseux sous anesthésie locale soigneuse à laide dun trocard de Jamshidi à usage unique, enfoncé sur une longueur de 1.5 à 2 cm en crête iliaque postéro-supérieure (crête iliaque antérieure si obésité ++) - Après extraction de la carotte, réaliser des empreintes sur lames, puis placer léchantillon dans un liquide de fixation formolé. Contre-indication absolue: traitement par anti-vitamines donc relais AVK par Héparine de bas poids moléculaire

26 Examens complémentaires en hématologie Biopsie de moëlle Résultat minimum de 72H pour avoir le résultat. Renseigne sur : richesse et structure du tissu myéloïde (différenciant hypoplasie et fibrose, les 2 pouvant entraîner un échec du myélogramme) présence et quantité de cellules anormales, par rapport au myélogramme - meilleure évaluation quantitative, voire détection surtout si foyers fibreux (lymphome, métastase ) - moins bonne définition cellulaire donc moins bonne catégorisation des cellules anormales Myélogramme et BM complémentaires et non substitutifs

27 Examens complémentaires en hématologie Ponction ganglionnaire (adénogramme) Quand? Bilan dune adénopathie isolée ou polyadénopathie Comment? Geste peu douloureux et facile à réaliser Prélèvement de suc ganglionnaire, par aiguille de taille petite /moyenne, avec /sans aspiration, après immobilisation du ganglion entre 2 doigts, puis projection sur 1 ou plusieurs lames de verre et étalement très doux* et séchage à lair. Si aspect purulent, renouveler laspiration pour étude bactériologique, avec aiguille plus grosse si pus épais. Si échec, renouveler avec aiguille plus grosse. Résultat coloration de MGG (idem myélogramme) délai moyen 48H. Réponse orale si urgence en 2H. rassure si aspect inflammatoire banal, concordant avec clinique et/ou hémogramme, mais la persistance dune adénopathie sans cause infectieuse prouvée biopsie oriente le Dg : pus (+ bactério), métastase, lymphome à confirmer par une biopsie

28 Examens complémentaires en hématologie Biopsie ganglionnaire Quand? devant une ou plusieurs adénopathies isolées non inflammatoires, non rapidement régressives, en labsence de contexte infectieux patent (angine, etc…) vérifier labsence de syndrome mononucléosique si possible après ponction permettant une orientation Comment? - Geste chirurgical sous AL ou AG, ou radiologique (micro-biopsies dirigées) - Si possible ne pas faire biopser en siège inguinal - Demander à biopsier ladénopathie la plus volumineuse, si possible entière et la faire envoyer à létat frais non fixé dans un délai de 2H maximum - prévenir le laboratoire, lui adresser des informations cliniques

29 Examens complémentaires en hématologie Biopsie ganglionnaire Techniques Au laboratoire dhématologie empreintes pour analyse cytologique dorientation immédiate immunophénotypage (CFM, immunocytochimie) cytogénétique / biologie moléculaire (clonalité, recherche de translocations) Au laboratoire danatomie pathologique coupes des blocs après inclusion en paraffine immunohistochimie (antigènes cellulaire, protéines anormales) recherche de virus ou de marqueurs géniques en hybridation in situ analyse de clonalité/recherche de translocations

30 Examens complémentaires en hématologie caryotype Quand? affirmer la clonalité dune anomalie hématologique (mais la relation clonalité-malignité nest pas absolue) mettre en évidence des anomalies spécifiques dune affection donnée, à visée diagnostique (LMC, certains types de lymhpomes malins), pronostique (ds leucémies aigües), ou suivi de maladie résiduelle Comment? Mise en évidence danomalies chromosomiques de nombre et/ou de structure (translocations, déltions, inversions…) par cytogénétique conventionnelle (dénombrement et classement des chromosomes après culture courte de 18 à 48H, bloquée au stade, métaphasique, analyse de 20 mitoses minimum) et/ou cytogénétique moléculaire par hybridation in situ fluorescente (FISH) ou peinture chromosomique, sur noyaux en métaphase ou interphase, permettant de préciser une anomalie, ou de la révéler si non trouvée sur le caryotype.

31 Jean Pierre A….– caryotype sang du Clone 1: 47,XY, +3, del(7)(q31q35)

32 Examens complémentaires en hématologie caryotype En pratique envoi de sang (3 tubes de 5cc), moëlle osseuse (1cc) sur tubes héparinés, AVANT Tt cortico- ou chimiothérapique nécessite 20 millions de cellules, délai de réponse minimum: 3-4 jours du lundi au vendredi (avant 14H), prévenir si arrivée tardive fragment de biopsie ganglionnaire frais non fixé pour les lymphomes malins Indications toutes les hémopathies où la cytogénétique a un intérêt diagnostique ou pronostique pouvant influencer le Tt Limites cellules tumorales trop peu nombreuses (pousse des cellules normales), ou non en cycle anomalies minimes anomalies génomiques et non chromosomiques, à rechercher en biologie moléculaire

33 Examens complémentaires en hématologie Étude du réarrangement des gènes des immunoglobulines ou du récepteur T Indications Recherche dune population monoclonale B ou T (pas dapproche de clonalité immunologique) - bilan initial - recherche de maladie résiduelle examen très spécialisé à discuter avec le biologiste Limites technique : absence de clone identifiable dans un lymphome malin Interprétation: Présence de clones contrôlés non malins chez sujets sains Le réarrangement des gènes des IG ou du TCR est spécifique de la cellule dans laquelle il se produit, donc de toute population tumorale (qui dérive par définition dune seule cellule-mère) Extraction de lADN cellulaire, utilisation de sonde spécifique de JH pour les Ig, du segment J du TCR, par PCR le + souvent


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