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Biologie moléculaire - jour 2. Commentaires J1  biomol = réactifs toujours sur glace (sinon = "Deadzyme")  produits en dehors du -20C le moins possible.

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1 Biologie moléculaire - jour 2

2 Commentaires J1  biomol = réactifs toujours sur glace (sinon = "Deadzyme")  produits en dehors du -20C le moins possible  « quick spin » avant d'ouvrir un tube  bien lire les notes de cours  % d'agarose  chauffer le λH3 (ne pas chauffer la sol n mère)  utiliser le P20 pour charger les gels (P10)

3 Commentaires J1  organisation/efficacité/planification  s'assurer que le gel soit prêt quand les digestions terminent  compte rendu/ménage/cahier durant la migration

4 Biologie moléculaire- organigramme Purification d’ADN de 2 plasmides à partir de cultures bactériennes Coupure des ADN par les enzymes de restriction Polymérisation en cascade (PCR) Analyse sur gels d’agarose (1%) Préparation des cartes de restriction et compte rendu Analyse sur gel d’agarose (0,8%) et compte rendu Analyse sur gel d’agarose (2%) et compte rendu Extraction et purification d’ARN de foie de lapin Analyse sur gel d’agarose (1%) et compte rendu  digestion des plasmides + gels d'agarose (compte rendu)  PCR

5 Plasmides  molécules d'ADN extrachromosomiques  ADN double brin + circulaire  répliquent de façon autonome  encodent résistance à un antibiotique  vecteurs de choix dans biologie moléculaire

6 Enzymes de restriction  clivent les 2 brins d’ADN à des séquences spécifiques (4-8 nt)  nommer pour l’organisme duquel c’était isolé (e.g. EcoRI est isolée d’Escherichia coli)  digestion produit 3 sortes de bouts

7 Enzymes de restriction  site de coupure = palindrome 5'-GGATCC-3' 3'-CCTAGG-5' 5’ 3’ 3’ 5’ Extension 5’ site de coupure (4-8 nt)

8 Enzymes de restriction  site de coupure = palindrome 5'-GGATCC-3' 3'-CCTAGG-5' 5’ 3’ 3’ 5’ site de coupure (4-8 nt) Extension 3’

9 Enzymes de restriction 5’ 3’ 3’ 5’ site de coupure (4-8 nt) Bouts francs

10 Enzymes de restriction  clivent les 2 brins d’ADN à des séquences spécifiques (4-8 nt)  nommer pour l’organisme duquel c’était isolé (e.g. EcoRI est isolée d’Escherichia coli)  digestion produit 3 sortes de bouts 1. extension 5’ 2. extension 3’ 3. bouts francs Bouts cohésifs

11 Enzymes de restriction - exemples BamHI 5'-G/GATCC-3' 3'-CCTAG/G-5' KpnI 5'-GGTAC/C-3' 3'-C/CATGG-5' convention biomol  toujours 5'  3'

12 Enzymes de restriction - exemples BamHI 5'-G/GATCC-3'5'-G 3'-CCTAG/G-5'3'-CCTAG-5' KpnI 5'-GGTAC/C-3'5'-GGTAC-3' 3'-C/CATGG-5'3'-C extension 5’ extension 3’ bouts cohésifs

13 Enzymes de restriction - bouts cohesifs BamHI 5'-G/GATCC-3' 5'-G 3'-CCTAG/G-5' 3'-CCTAG GATCC G

14 Enzymes de restriction

15  gel d'agarose (attention: % d'agarose) Analyse des digestions

16  gel d'agarose (attention: % d'agarose)  graphique log taille vs distance (un par gel) Analyse des digestions

17  gel d'agarose (attention: % d'agarose)  graphique log taille vs distance (un par gel) Analyse des digestions M Taille (pb) ligne des puits

18 Graphique - log taille vs distance  pas linéaire  pas de courbe de tendance (droite)

19 Graphique - papier semi-log  graphique de taille vs distance sur papier semi-log  bandes de 250 à 10000pb (1 kpb ladder) taille (pb) distance (cm)

20 Graphique - log taille vs distance  pas linéaire  pas de courbe de tendance (droite) Distance de migration=18cm log 10 taille = 3,05 taille = 1100 pb

21  gel d'agarose (attention: % d'agarose)  graphique log taille vs distance (un par gel)  résultats utilisés pour établir la carte de restriction du plasmide Analyse des digestions

22  enzyme qui coupe 1 fois est utilisée pour estimer la taille du plasmide Carte de restriction

23  enzyme qui coupe un plasmide de 4,5 kpb deux fois séparées de 1,5 kpb (1000 pb = 1 kpb) Carte de restriction 2 sites 2bandes2bandes

24 Exercice: carte de restriction Information: enzyme fragments# de sites BamHI 9+6 kpb EcoRI 10+5 SalI 15 BamHI / EcoRI7, 3 X2, 2 kbp BamHI / SalI 9, 5, 1 EcoRI / SalI 10, 3, 2

25 Information: enzyme fragments# de sites BamHI 9+6 kpb EcoRI 10+5 SalI 15 BamHI / EcoRI7, 3 X2, 2 kbp BamHI / SalI 9, 5, 1 EcoRI / SalI 10, 3, 2 I er étape: nombre de site(s) par enzyme Exercice: carte de restriction N’oublier pas que le plasmide est circulaire! 2 2 1

26 Information: enzyme fragments# de sites BamHI 9+6 kpb 2 EcoRI SalI 15 1 BamHI / EcoRI7, 3 X2, 2 kbp BamHI / SalI 9, 5, 1 EcoRI / SalI 10, 3, 2 2 ième étape: taille Exercice: carte de restriction 15 kpb (±)

27 Exercice: carte de restriction Information: enzyme fragments# de sites BamHI 9+6 kpb 2 EcoRI SalI 15 1 BamHI / EcoRI7, 3 X2, 2 kbp BamHI / SalI 9, 5, 1 EcoRI / SalI 10, 3, 2 3 ième étape: placer EcoRI EcoRI 5 10

28 Exercice: carte de restriction EcoRI 10 5 SalI 2 3 Information: enzyme fragments# de sites BamHI 9+6 kpb 2 EcoRI SalI 15 1 BamHI / EcoRI7, 3 X2, 2 kbp BamHI / SalI 9, 5, 1 EcoRI / SalI 10, 3, 2 4 ième étape: placer SalI

29 Exercice: carte de restriction EcoRI SalI 2 1 BamHI Information: enzyme fragments# de sites BamHI 9+6 kpb 2 EcoRI SalI 15 1 BamHI / EcoRI7, 3 X2, 2 kbp BamHI / SalI 9, 5, 1 EcoRI / SalI 10, 3, 2 5 ième étape: placer les BamHI

30 Exercice: carte de restriction Information: enzyme fragments# de sites BamHI 9+6 kpb 2 EcoRI SalI 15 1 BamHI / EcoRI7, 3 X2, 2 kbp BamHI / SalI 9, 5, 1 EcoRI / SalI 10, 3, 2 5 ième étape: placer les BamHI EcoRI 2 1 SalI BamHI kpb

31 Exercice: carte de restriction Information: enzyme fragments# de sites BamHI 9+6 kpb 2 EcoRI SalI 15 1 BamHI / EcoRI7, 3 X2, 2 kbp BamHI / SalI 9, 5, 1 EcoRI / SalI 10, 3, 2 6 ième étape: vérification EcoRI SalI BamHI 2 3 (15 kpb)

32  conçu en 1983 par Kary Mullis (prix Nobel en 1993)  changé le cours de la biologie moléculaire PCR

33  produit, in vitro, des nombres gigantesques de copies d'une séquence d'ADN spécifique d'un mélange d'ADN  basé sur le fonctionnement cyclique d'un ADN polymérase PCR

34  synthèse de l’ADN en ajoutant des nucléotides au bout 3'-OH d’un l'amorce hybridé à un brin d’ADN matrice  direction de synthèse est 5'→3'.  précurseur est un dNTP qui perd les deux phosphates en position terminale ADN polymérases

35 matrice amorce

36 ADN polymérases matrice amorce

37 PCR - étapes du cycle

38 N.B. La polymérase doit être thermostable.

39 PCR - étapes du cycle Amorce 5 ' Amorce 3 '

40 PCR - étapes du cycle Amorce 5 ' Amorce 3 '

41 nombre de copies = 2 n (n = # de cycles) PCR - une amplification

42 nombre de copies = 2 n (n = # de cycles) PCR - une amplification Énorme! Copies produites

43 PCR song

44 Enzymes-tampons-nucléotides-marqueurs  1 boîte/table à -20 o C  gardez sur glace en tout temps  retournez les tubes à -20 o C après l'utilisation (ne jeter pas les restants!)  courte centrifugation avant d'ouvrir un tube

45 Enzymes-tampons-nucléotides-marqueurs  1 boîte/table pour vos échantillons d'ADN (bien les identifier, ne pas jeter vos PCRs)  pas de réaction de PCR = perte de points  HindIII vs λH3

46 Point technique - volumes en biomol  biologie moléculaire = petits volumes (~10 μL)  soyez prudent dans vos pipettages (P10)  toujours sur glace  vérifier le volume aspiré  rentrer l'embout dans le liquide avant la livraison  surveiller la livraison  il faut mettre les tubes de 200 et de 500 μl dans des tubes de 1,5 ml pour les centrifuger

47 Points techniques - digestions Digestions  utilisez 6/12 μl d'ADN / digestion - 6 μl pour les digestions simples - 12 μl pour les digestions doubles

48 Points techniques - digestions  Digestions simples:  10 μl volume final  1 μl enzyme*  Digestions doubles:  20 μl volume final  1 μl de chaque enzyme* (i.e. 2 μl total d'enzyme) *Seulement 10% du volume final peut être enzyme. Pourquoi? Garder les enzymes en dehors du congélateur le minimum possible (quick spin avant d'ouvrir).

49 Points techniques - gel d'agarose  utilisez le peigne avec 8 (Pharmacia) ou 10 dents (Labnet)  préparer deux gels (1%) de 60 ml (Pharmacia) ou 100 ml (Labnet) / équipe Gel #1: digestions de plasmide A Gel #2: digestions de plasmide B

50 Points techniques - gel d'agarose  chargez 12 μl digestions simples 15 μl digestions doubles (pas les 24 μl)  N'OUBLIEZ PAS DE METTRE LE STANDARD (1KB LADDER) SUR LES DEUX GELS!!!!

51 Mise en garde...  aucun site  activité étoile et digestions partielles

52 Mise en garde...  aucun site  activité étoile et digestions partielles  superposition de fragments de même taille

53 Mise en garde - superposition de bandes Ex. plasmide d'une taille 6,4 kpb qui donne seulement des bandes de 2,9 et de 0,75 kpb ,43,76,4Total (kpb): Clairement, il y a 2 bandes ici (2,9 + 2,7 kpb).

54 Mise en garde...  aucun site  activité étoile et digestions partielles  superposition de fragments de même taille  fragments de restriction trop petits pour être visibles sur le gel (surexposer lors de la photographie)

55 Points techniques - PCR  amplification, alors il faut être en garde pour de la contamination  embouts avec barrières (attention: choisir les bons, uniquement pour les réactions de PCR, $$$)  soyez prudent de ne pas contaminer vos solutions (tampons, eau, nucléotides, etc.)  diluer votre ADN plasmidique 1/20

56 Points techniques - PCR contamination  amplification, alors il faut être en garde pour de la contamination non-contaminécontaminé plasmide +ve plasmide –ive contrôle +ve contrôle -ive

57 Point technique - nucleases  embouts + tubes stériles  toujours portez des gants et changez-les souvent  remplir les boîtes uniquement quand vide (sinon, dans tiroir)  portez des gants quand vous remplissez les boîtes d’embouts  boîtes remplies à l'autoclave

58  solutions préparées semaine I 1.TAE 50X Points techniques

59 Compte rendu - présentation des photos  à compléter au labo  sur les images des gels faire attention de:  identifier les puits  indiquer les tailles des bandes du marqueur  indiquer, si le marqueur est "synthétique", le fournisseur

60 Marqueurs de taille  utiliser pour déterminer la taille de l’ADN  préparation de l'échantillon ADN (=1 kpb ladder)5 µl 10X OPA2 µl H 2 O3 µl 6X LB2 µl 12 µl

61 Compte rendu - tailles des fragments  log taille vs distances de migration des bandes du marqueur  papier semi-log (alors taille vs distance)  à main  pas de courbe de tendance  un graphique pour chaque gel!

62 Biologie moléculaire - questions ADN plasmidique superenroulé


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