Transcriptome : application en santé publique

Présentation au sujet: "Transcriptome : application en santé publique"— Transcription de la présentation:

1 Transcriptome : application en santé publique
C. Hourioux Techniques moléculaires d'hybridation et leurs applications.

2 Notion de biomarqueurs :
> désignent des caractéristiques mesurées objectivement (c’est à dire avec précision et reproductibilité) et évaluée comme indicateur. > Outils d’origine biologique permettant de distinguer un état médical normal d’un état pathologique, ou d’une réponse à un traitement thérapeutique. Recherche appliquée Recherche fondamentale

3 Ou sont les Biomarqueurs ?
ADN Génome Génomique Transcription ARNm Transcriptome Transcriptomique Traduction Post génomique Protéine Protéome Protéomique Métabolome Fonctions / Métabolisme métabolomique

4 Biomarqueurs : donner une image la plus complète de la pathologie
Prévention Diagnostic Pronostic : biomarqueur permet de déterminer l’évolution prévisible de la maladie Choix thérapeutique : biomarqueur rend compte des cibles thérapeutiques possibles et du stade de la maladie. Suivi thérapeutique / rémission : efficacité du traitement (« traitement à la carte / médecine personnalisée ») Toxicité : biomarqueurs de toxicité du médicament Choix des industriels : Développement du couple Biomarqueurs <=> médicament

5 Etude du Transcriptome <=> Recherche de nouveaux biomarqueurs

6 Exemple du cancer

7 Virologie : Lignée hépatocytaire infectée avec
Le virus de l’hépatite C. (étude des voies impliquées dans l’immunité innée) Identification de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles

8 Microbiologie :

9 Biomarqueurs en microbiologie :
Typage fin : résistance antibiotiques, virulence génotypage, chaînes de transmission (origine contamination, contamination nosocomiales…) Bactéries Bactéries : S. aureus, M. tuberculosis … virus : HPV, HIV, virus resp. infections respiratoires … Autres applications : alimentation, bioterrorisme, environnement …

10 Cancer : Biomarqueurs actuels :
Prévention Diagnostic Pronostic : Choix thérapeutique Suivi thérapeutique / rémission Toxicité … Biomarqueurs Cancer : Biomarqueurs actuels : Marqueurs classiques prédictifs/pronostics du typage histo-clinique des tumeurs : Cliniques : âge, sexe, stade d’extension… Histologiques : ganglions, taille, grade, récepteurs hormonaux… Progrès mais insuffisants : bon pronostic : % d’échec mauvais pronostic : % d’échec => Sous classes non identifiées. => Analyses moléculaires à grandes échelles. => Elaboration d’un panel de biomarqueurs. Constat actuel : Déficit de (combinaisons de) biomarqueurs moléculaires réellement prédictifs Conséquence : problèmes d’adéquation entre traitement et sous type / classe de tumeur.

11 Applications actuelles des biopuces = 0 !!
Biopuces = microarrays = puces à ADN Mise au point très longue Difficultés techniques : reproductibilité Validation (par centres de références …) Coûts >> outils de recherche fondamentale >> Cancerologie : outil très utilisé Nombreux gènes impliqués dans la cancérogenèse Ici, on s’interessera surtout au cancer

12 Importance de la détection précoce (cancer) .

13 Importance du typage des tumeurs :
Taille tumeur Node (atteinte ganglions) Métastases Tumeur X Evaluation imparfaite Classification TNM (Phénotypique) Prise en charge thérapeutique Evaluation pronostique … Evolution vers Classification moléculaire Meilleure prise en charge

14 Pourquoi les biomarqueurs actuels reflètent de façon incomplète une pathologie (ex: cancer) :
Exemple du cancer : accumulation progressive d’altérations moléculaires dont les effets se combinent vers l’apparition de la tumeur avec une évolution vers un phénotype de plus en plus agressif et résistant aux traitements.

15 Classification des tumeurs :
Classification TNM >> Classification moléculaire TNM 10 tumeurs Moléculaire Définitions en Stades

16 Classification Moléculaire des tumeurs :

17 Transcriptome ?? ADN ARNm Protéine Génome Transcriptome Protéome
Génomique Transcription ARNm Transcriptome Transcriptomique Traduction Post génomique Protéine Protéome Protéomique Métabolome Fonctions / Métabolisme métabolomique

18 Biomarqueurs : présents à différents niveaux.
Hépatocyte Entérocyte = = Génome = = Transcriptome DIFFERENCIATION CELLULAIRE / FONCTIONNELLE = = Protéome = = Métabolome

19 Etude de la cellule : différents niveaux.
normale Cellule cancéreuse = =(avec anomalies) Génome = = Transcriptome DIFFERENCIATION CELLULAIRE / FONCTIONNELLE = = Protéome = = Métabolomique

20 Biomarqueurs : mieux refléter l’inter-connexion des mécanismes de la cellule :
Comprendre Interdépendance du fonctionnement : des gènes (« réseau de gènes ») des protéines Etc … Comprendre les Mécanismes séquentiels de l’oncogenèse Comprendre les Mécanisme d’action des traitements et en élaborer de nouveaux (>> adaptation des traitements à la cible thérapeutique) « suivre » de façon précise l’évolution de la maladie (depuis le diagnostic, notion de maladie résiduelle) Identifier la combinaison de biomarqueurs qui fera mieux que chaque biomarqueur pris isolément : la « signature moléculaire »

21 Emergeance des techniques de typage moléculaire à grande échelle :
Mesure de 100 à plusieurs milliers de paramètres simultanément (notion de screening haut débit) Tout ce qui est en « omique » Etablir des « signatures moléculaires » <=> pathologies (>> cancer) - Séquençage et hybridation sur microarrays - Hybridation génomique comparative (CGH Array) Génomique Transcriptomique Protéomique - SAGE - Puces à ADN / profil d’expression… - Electrophorèse 2D - Spectrometrie de masse (MALDI- /SELDI-TOF) - Puces à protéines Chromatographie … Tissus arrays

22 Typage moléculaire à grande échelle : les techniques

23 Etude du transcriptome :
Etude de l’ARN (étapes d’extraction, purification, contrôle d’intégrité, dosage). Différentes techniques : Northern Blot RT-PCR et RT-PCR quantitative Puces à ADN (hybridation ARN-ADN) Une grande constance dans ces techniques : l’HYBRIDATION

24 Hybridation : principes généraux.
Spécificité Réversibilité Tm DO (Quantité ADN) QADN/2 T° Tm = 2 (w.A + x.T) + 4 (y.G + z.C)

25 Paramètres influant sur le Tm
composition en bases G/C et A/T longueur fragment ADN Présence de sels (Na  <> Tm ) - Température Tm DO (Quantité ADN) QADN/2 T° Formule de Calcul du Tm simplifiée Tm = 2 (w.A + x.T) + 4 (y.G + z.C)

26 Application du Tm : + T° Tm T° < Tm DO QADN/2 T° = Tm T° > Tm
(Quantité ADN) QADN/2 T°

27 Application pratique de l’hybridation : ADN
: SONDE T° + : ADN Double brin Détection T° +

28 Application pratique de l’hybridation : ARN
: SONDE ARNs : ADN Double brin Détection T° +

29 Hybridation et sondes T° +
- Marquage de la sonde synthèse in vitro avec une base marquée : « chaud »  radioactif (32P) « froid »  digoxigénine +Ac spécifique-enzyme, fluorescence - Hybridation : ADN/ADN ADN/ARN Spécificité de l’hybridation : lavages en variant la T° et [sels] + T° Détection

30 Extraction des acides nucléiques : objectif >>> pureté et qualité

31 Principe de l’extraction des acides nucléiques :
Lyse des cellules, digestion des protéines, extraction. Trizol …

32 Dosage quantitatif /qualitatif des ARNs :
ARNs => FRAGILES !! ADN

33 Dégradation des ARNs : ratio ARN 28S / ARN 18S
Extraction et contrôle qualité : une étape nécessaire pour assurer La validité des résultats.

34 Le Northern Blot. Même technique générale que le southern blot.
Extraction des ARNs Électrophorèse d’ARNs Sondes marquées ADN Hybrides ARN-ADN >> 1 gène / expérience

35 Northern blot : semi quantitatif

36 PCR et RT PCR quantitative.

37 Résultats PCR quantitative :

38 MÊME AMPLIFICATION RÉPÉTÉE N FOIS  = cycle 24/25

39 Quantification : ex des transcrits de fusions

40 RT PCR : conclusions Très sensible et spécifique.
Utilisable au diagnostic mais aussi en suivi Facile à mettre en œuvre Coûts de - en - élevés 1 ou quelques paramètres mesurés : insuffisant pour les pathologies multifactorielles

41 Puces à ADN et transcriptomique : comprendre la complexité (cancers)

42 Puces à ADN : Analyse différentielle.
Cellule normale Cellule cancéreuse = =(avec anomalies) Génome = = Transcriptome = = Protéome >> Comparaison aussi possible entre deux types de tumeurs.

43 Puces à ADN Détection T° +

44 Historique : Macro/micro arrays
Micro arrays : jusqu’à 20000 Sondes sur une lame de verre (fluorescence) PUCES A ADN PANGENOMIQUE

45 >> +s milliers de gènes / 1 expérience
Puces à ADN (1):

46 Puces à ADN (2):

47 Puce à ADN (3)

48 Puces à ADN (4)

49 Puces à ADN (5) : découverte de biomarqueurs pronostic.
Routine hospitalière : RT PCR quantitative (sélection du/des marqueur(s), validation et test, mise en application en routine)

50 Prédiction du risque métastatique

51 L’analyse des résultats : la recherche de clusters de gènes ayant des profils d’expression similaires.

52 Plusieurs versions de puces :

53 Les différentes techniques d’élaboration d’un micro-array

54 Les problèmes liés à la technique :
Qualité, homogénéité et reproductibilité de l’extraction de l’ARN. Homogénéité de la RT ? Transcriptome de référence ?? Technique de fabrication des puces. Analyse informatique complexe, interprétation, bio-informatique… Reproductibilité entre plateformes matérielles Cout élevé, retombées commerciales ??

55 Préparations échantillons
Contraintes : Biothèques 100 Echantillons Préparations échantillons Mesure Biomarqueurs 10 000 Biomarqueurs Lecture des résultats Valeurs num. À traiter Analyse des résultats avec la clinique

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59 Un remède pour l’homogénéité de l’échantillon : la micro-dissection laser

60 Le matériel utilisé pour les dépots
Gros besoins en robotique (miniaturisation, microélectronique, microfluidique, informatique) …

61 Une approche complémentaire au microarray : le tissu-array (validation des résultats du microarray)

62 Domaines d’application des micro arrays.
Recherche fondamentale, médicale, pharmaceutique Diagnostic & thérapeutique Santé Publique, agroalimentaire et environnement Génie biologique et biotechnologie

63 Application des microarrays en microbiologie :