Dénturation/hybridation Population A Tester Population B Driver RNA RNA RT avec oligodT cDNA Dénturation/hybridation Excès de driver Clonage dans.

Présentation au sujet: "Dénturation/hybridation Population A Tester Population B Driver RNA RNA RT avec oligodT cDNA Dénturation/hybridation Excès de driver Clonage dans."— Transcription de la présentation:

1

2

3 Dénturation/hybridation
Population A Tester Population B Driver RNA RNA RT avec oligodT cDNA Dénturation/hybridation Excès de driver Clonage dans un vecteur

4 Criblage de la banque Hybridome T spécifique d’un antigène Y
d’un antigène X Isolement des ARN polysomaux associés aux membranes ARN polyA+ cDNA ARN polyA+ Soustraction en utilisant un lymphome B Synthèse des cDNA en présence de dXTP a32P Synthèse du second brin Soustraction en utilisant un lymphome B Construction d’une banque par clonage dans pBR322 Criblage de la banque 35 clones 30 spécifiques des cellules T

5 Cellules T

6 Extraction ARN : 2 échantillons A et B
GCAAAAA CGTTTTTT RT avec amorces poly(T)12MN GCAAAAA CGTTTTTT CGTTTTTT PCR Amorces poly(T)12MN Décamères arbitraires A B Identification (base de données) Excision, extraction, PCR et clonage dans un vecteur Séquençage Vérification de l’expression différentielle Migration sur gel polyacrylamide autoradiographie

7 Marquage Marquage

8 cDNA array

9

10 5’ 3’ PM : A t c g t c g t t a t c g t t g c t g c MM : A t c g t c g t t g t c g t t g c t g c MM PM

11 Marquage de la sonde Hybridation cDNA T7 B cRNA B B B (T7RNA pol)

12 Fabrication des puces

13

14 SAGE : Serial Analysis of Gene Expression
SAGE permet une analyse de la fréquence d'un ARN messager parmi les milliers produits dans une cellule à un moment donné. Une étiquette (tag) est une séquence de 10 ou 14 nucléotides caractéristique d'un ARNm d'une cellule. Les étiquettes, isolées grâce à l'action des enzymes de restriction, sont liées bout à bout en une seule séquence qui est clonée, amplifiée par PCR et séquencée. Analyse informatique du taux d'expression des ARNm à partir de cette séquence. Une courte séquence de 10 à 14 nt permet d’identifier un transcrit : TAG Ces séquences peuvent être liguées entre elle dans un vecteur puis séquencées La fréquence avec laquelle un TAG est observée est proportionnelle au niveau d’expression

15

16

17

18