GALERIE API 20E : ensemencement, lecture et interprétation

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1 GALERIE API 20E : ensemencement, lecture et interprétation

2 La galerie API 20 E Microtube contenant le milieu déshydraté
1- Présentation de la galerie Galerie de 20 microtubes prêts à l’emploi permettant de réaliser 23 tests biochimiques afin d’identifier des bacilles Gram – appartenant à la famille des ENTEROBACTERIACEAE. Cupule Microtube contenant le milieu déshydraté

3 1- GALERIE API 20E : son ensemencement

4 La galerie API 20 E Microtube contenant le milieu déshydraté
1- Présentation de la galerie Galerie de 20 microtubes prêts à l’emploi permettant de réaliser 23 tests biochimiques afin d’identifier des bacilles Gram – appartenant à la famille des ENTEROBACTERIACEAE. Cupule Microtube contenant le milieu déshydraté La suspension bactérienne introduite dans le tube dissout les substrats déshydratés.

5 Préparation de l’inoculum pour ensemencer la galerie API 20 E
1 seule colonie sur GO isolement Prélèvement d’une souche pure sur GNI 5 mL d’eau distillée stérile 5 mL d’eau distillée stérile Souche pure sur GNI

6 Ensemencement de la galerie API 20E
Introduire la suspension bactérienne dans chaque tube à l’aide d’une pipette Pasteur stérile ouverte, pointe appuyée à l’intérieur et sur le côté pour éviter la formation de bulles Pour certains caractères: Remplir le tube de suspension puis Recouvrir d’huile de paraffine Pour les tests : ADH, LDC, ODC, H2S, URE Remplir de suspension le tube et la cupule Pour les tests : CIT VP GEL

7 2- GALERIE API 20E : sa lecture

8 2-1- Les réactifs à ajouter pour la lecture

9 4- Lecture de la galerie API 20 E
Après 24h d’incubation à 37°C, cupules ans lesquelles on doit rajouter des réactifs 4- Lecture de la galerie API 20 E Chlorure de fer III Napht-1-ol Naphtyl-1-amine

10 2-2- Aspect des résultats positifs et négatifs

11 Tests positifs après ajout des réactifs utiles
Les 10 premiers tests Tests négatifs 4- Lecture de la galerie API 20 E + Réactif TDA + Réactif Kovacs + Réactifs VP 1 et 2 Tests positifs après ajout des réactifs utiles + Réactif TDA + Réactif Kovacs + Réactifs VP 1 et 2

12 Les 10 derniers tests Tests négatifs Tests positifs
Après ajout des réactifs Nit 1 et Nit 2 : lecture de la NR (ici NR +)

13 2-3- Explication des résultats positifs

14 Galactose + orthonitrophénol jaune
ONPG Mise en évidence de la béta-galactosidase Substrat : ONPG Réaction : ONPG + eau Galactose + orthonitrophénol jaune

15 ADH, LDC, ODC Mise en évidence de : - l'arginine désaminase
- lysine décarboxylase - ornithine décarboxylase Substrats : - arginine (dans ADH), - lysine (dans LDC) - ornithine (dans ODC) Réactions : dégradations libérant des produits basiques Révélateur : rouge de phénol Rouge/Rose = + Jaune/Orangé = - Rouge/Orangé = + Jaune = -

16 Citrate Mise en évidence de la dégradation du citrate comme seule source de carbone. Réaction : dégradation consommant des H+, donc responsable d’une alcalinisation. Substrat : citrate Révélateur : BBT

17 H2S Mise en évidence de production de sulfure
Substrat : thiosulfate de sodium Révélateur : Fe3+ Résultat positif : présence d’un précipité noir de sulfure de fer

18 Urée Mise en évidence de la présence d'une uréase Substrat : urée
Réaction : urée + eau CO2 + 2 NH3, d’où alcalinisation. Révélateur : Rouge de phénol Lecture : attention un orange clair sera -, un orange foncé sera considéré comme +

19 TDA Mise en évidence d'une tryptophane désaminase
Substrat : Tryptophane Produit obtenu : Acide indol pyruvique Révélateur : - Réactif ajouté : Chlorure de fer III donnant un produit marron foncé en présence d’acide indol pyruvique

20 Indole Mise en évidence d'une tryptophanase Substrat : Tryptophane
Produit : Indole Révélateur : - Réactif ajouté : Kovacs (ou James)

21 Voges Proskauer Mise en évidence de la production d'acétoïne, de 2,3 butane diol et de butane dione Substrat : Pyruvate Révélateur : - Réactifs ajoutés : VP1 et VP2 (1- naphtol et KOH)

22 Lecture directe ou indirecte
TABLEAU DE LECTURE DE LA GALERIE MINIATURISÉE API 20E Microtube Substrat : Caractère recherché  Révélateur Lecture directe ou indirecte Test (si nécessaire) Résultat - Résultat + ONPG ONPG = Ortho-Nitro-Phényl-Galactoside ADH LDC ODC Arginine Lysine Ornithine Rouge de phénol CIT Citrate H2S Thiosulfate de sodium Fe III URÉ Urée TDA Tryptophane IND VP Pyruvate de sodium GEL Gélatine Particules de charbon GLU à ARA = zymogramme Substrat carboné (glucide) NO2- / N2 Nitrates (NO3-) Béta galactosidase Lecture directe Arginine Dihydrolase Lysine Décarboxylase Ornithine Décarboxylase Lecture directe BBT Utilisation du citrate Lecture directe Production d’H2S Lecture directe Rouge de Phénol Uréase Lecture directe Lecture indirecte Ajouter une goutte de réactif chlorure de fer III Tryptophane désaminase Lecture indirecte Ajouter une goutte de réactif Kovacs Tryptophanase ou production d’indole Lecture indirecte Ajouter 1 goutte de VP1 et VP2 Attendre 10 minutes production d’acétoïne (3-hydroxybutanone gélatinase Lecture directe Utilisation de substrats carbonés (glucides) BBT BBT Lecture directe Lecture indirecte Ajouter 1 goutte de NIT1 et NIT2 et zinc éventuellement Nitrate réductase

23 son interprétation (identification de la souche)
3- GALERIE API 20E : son interprétation (identification de la souche)

24 Validation et possibilité d’interprétation si :
Cupule Glu + Ou 3 autres cupules au moins positives

25 Démarche d’identification : - apporter la preuve que la bactérie appartient bien à la famille des Enterobacteriaceae (montrer qu’elle a les 7 caractères définissant la famille) - identifier le genre, voire l’espèce : * approche dichotomique, ou utilisation de tableaux des caractères * codage API * approche probabiliste utilisant un logiciel informatique

26 5- Identification de la souche
Lecture des résultats de la galerie : - + + + + 5 2 1 5 7 7 3 5 5 Résultats reportés sur la fiche d’identification Code n°: (55) Se référer au catalogue pour identifier la souche à l’aide du code

27 5- Identification de la souche (suite)

28 Méthode d’identification probabiliste (p340 DTK)
Le nom du micro-organisme est obtenu par un calcul de probabilité A chaque caractère d’un micro-organisme donné fait référence une probabilité d’être + ou – La probabilité que ce soit un taxon donné correspond aux produits des probabilité attribué à chaque caractère (si + = % de positivité ou si - =100%-% de positivité) = Le logiciel classe tous les résultats pour donner le ou les taxons les plus probables.

29 typicité Indice de typicité : comparaison entre le profil trouvé et le profil réel de la souche