ETUDE CYTOBACTERIOLOGIQUE DES URINES

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1 ETUDE CYTOBACTERIOLOGIQUE DES URINES
D.TIOUIT Service de microbiologie HCA D.TIOUIT Etude cytobactériologique des urines 23/12/2012

2 A- INTRODUCTION. Une pathologie fréquente. Complications
A- INTRODUCTION * Une pathologie fréquente. * Complications * Conséquences sur le coût des soins et le développement des résistances. * E C B U = Dc formel de toute infection, Qualité du prélèvement technique rigoureuse au laboratoire Critères d’interprétation reconnus. * 4 éléments décisionnels  pour la prise en charge correcte d’une infection urinaire : - Clinique  - Bactériologique  Epidémiologique  - Pharmacologique  * Dc de la tuberculose exclu (Symptomatologie circonstances de découverte, méthodes de Dc bactériologique, Germes, Trts différents et souvent atteinte mixte) .

3 B. DEFINITIONS * Nombre significatif de bactéries qui se développent au niveau des voies excrétrices urinaires. * Selon l’organe touché : - Cystite. - Pyélonéphrite. - Prostatite. *Colonisation *IU  simple *IU compliquée : anomalie urologique, maladie générale (insuffisance rénale, maladie de système notamment diabète ou immunodépression) , femme enceinte, PNA chez l’homme ...

4 C. RAPPELS ANATOMOPHYSIOLOGIQUES : I. RAPPEL ANATOMIQUE
C. RAPPELS ANATOMOPHYSIOLOGIQUES : I. RAPPEL ANATOMIQUE - L’appareil urinaire s’étend des reins au méat urétral. - Au niveau du rein, des papilles calicielles s’opposent au reflux intra rénal. - Des mouvements péristaltiques urétéraux favorisent l’écoulement de l’urine du rein vers la vessie. - Un système anti reflux au niveau de la jonction urétéro -vésicale évite le reflux des urines vers le rein lors de la miction. - La vessie s’évacue par l’urètre. - Un double sphincter existe du niveau de la jonction urétéro -vésicale et assure la continence : Sphincter lisse : à commande réflexe. Sphincter strié : à commande volontaire.

5 SCHEMA DE L’APPAREIL URINAIRE
Rein Infections urinaires hautes STERILE Uretère Vessie Infections urinaires Basses FLORE Urètre

6 Schéma de l’appareil uro-génital féminin ( coupe sagittale )
Schéma de l’appareil uro-génital masculin ( coupe sagittale )

7 II. PORTES D’ENTREE : VOIE DESCENDANTE VOIE ASCENDANTE
voie hématogène ,rare septicémie, abcès rénal… VOIE ASCENDANTE germes d’origine intestinale +++ à partir de la flore colique les bactéries atteignent la vessie cystite L’infection peut se propager vers l’uretère, le rein (pyélonéphrite), la prostate (prostatite). Autre voie Exceptionnelle Urines infectées par effraction de l’arbre urinaire traumatisme, tumeurs, fistules

8 III. FACTEURS FAVORISANT L'INFECTION URINAIRE : 1
III. FACTEURS FAVORISANT L'INFECTION URINAIRE : 1.Facteurs liés à la bactérie elle-même : a- Facteurs d'adhésion (fimbriae) et autres facteurs non spécifiques, non liés aux Fimbriae : Escherichia Coli : ** Adhésine  ** Toxines  ** Antigène de surface  Ago : portion externe du LPS de la membrane externe du paroi Agk : polysaccharide capsulaire - Proteus mirabilis : Adhésine , Flagelles ,Hémolysine et protéase, Uréase ( pH ) - Staphylococcus saprophyticus : * adhésion à l’urothélium par liaison relative à un résidu lactosamine. * production de slime et d’enzymes. b- I’ inoculum bactérien :

9 2. Facteurs liés à I'hôte : a- Anomalies morphologiques de I’ arbre urinaire. b- Faible réponse immunitaire de I’ hôte : grossesse, diabète, jeune enfant… c- Hygiène de vie : Boissons en quantité insuffisante.

10 Réactions inflammatoires et immunitaires.
IV. MOYENS DE DÉFENSE DE L’HÔTE : Diurèse importante (1.5l/j) Mictions fréquentes (4 – 5/j ) : le flux d’urine délivré par les reins diminue la concentration d’urine. PH acide des urines ( < 5,5 ) Osmolarité faible ( ‹ 200 miliosmol ) Concentration élevée d’urée urinaire et autres acides organiques Chez l’homme : Sécrétions prostatiques acides Longueur de l’urètre Intégrité de la muqueuse vésicale Rôle bactéricide du mucus vésical La présence d’IgA sécrétoires empêche l’adhérence des bactéries sur les cellules épithéliales. Réactions inflammatoires et immunitaires.

11 D . DONNEES EPIDEMIOLOGIQUES Chez l’adulte : L’incidence différente selon le sexe et l’âge : Fréquente chez la femme ( données anatomiques). Trois pics : - Les premières relations sexuelles. - La grossesse - La ménopause USA : - Incidence des cystites = 0.5 à 0.7% par an chez les femmes en période d’activité génitale à 30% des femmes auraient eu au moins un épisode d’infection urinaire entre 30 et 40 ans. France : En 1996, la prévalence a été de 3 à 8% pour les femmes et de 0.5 à 2% pour les hommes. Une femme sur 2 aurait au minimum un épisode de cystite aiguë dans sa vie, soit une incidence annuelle d’environ 2 millions. Chez l’homme : - IU très rare avant 50 ans - Souvent associée à des anomalies urologiques ou à une prostatite. - Sa fréquence augmente régulièrement avec l’apparition de l’adénome prostatique.

12 Chez le nourrisson et l’enfant : - 3 à 4 mois :
L’incidence de l’infection est également très différente selon le sexe. - 3 à 4 mois : IU grave, septicémique dans 20 à 30% des cas. Plus fréquente chez le garçon Fréquence oscille autour de 1% Souvent associée à une malformation. Chez l’enfant d’âge scolaire : 3 à 5% les filles ayant des IU (court trajet urétral et contiguité uro-génitale) La fréquence chez le garçon est de 1 à 2 % . La fréquence des IU augmente également chez les diabétiques, les immunodéprimés, les porteurs de sonde ainsi que chez les personnes alitées.

13 E-ÉTIOLOGIES BACTÉRIENNES I / Étiologies bactériennes
De nombreux micro-organismes peuvent infecter les voies urinaires mais les agents les plus fréquents sont : Les BGN qui font partie du tube digestif et sont responsables de plus de 90% des infections urinaires. Les germes les plus fréquemment en cause sont les Entérobactéries avec en tête : * Escherichia coli ( 60 à 70%) * Suivie de Proteus et de * Klebsiella

14 Les cocci à Gram positif sont aussi retrouvés avec cependant une fréquence moins élevée. On distingue : * Les staphylocoques non producteurs de coagulase (Staphylococcus Saprophyticus surtout). * Le streptocoque du groupe B( femme enceinte) * Les Entérocoques commensaux du tube digestif, de la muqueuse urétérale, de la peau. Ils se rencontrent fréquemment comme contaminant. On peut aussi isoler Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter, Serratia, Candida albicans surtout dans les IUN. Nous rapportons dans les tableaux ci-dessous les résultats d’une enquête prospective effectuée du 01 juin 2004 au 20 avril 2007, dans l’algérois, sur les étiologies bactériennes et les résistances aux antibiotiques .

15 Etiologies bactériennes chez les patients externes (3000).
Espèces ou groupe d'espèces Global (%) F (%) M (%) BGN 91,70% Entérobactéries 88,83% Escherichia coli 62,37 72,53 42,9 Klebsiella spp* 11,7 8,79 17,2 P. mirabilis 7,63 5,08 12,3 Autres Proteus, 3,23 0,96 7,39 Morganella, Povidencia Autres entérobactéries 3,9 2,28 6,89 BGNnon fermentaires 2,87% Acinetobacter spp 0,17 0,05 0,5 Pseudomonas spp 2,7 0,76 6,4  Cocci à Gram positif 8,3% S. aureus 0,83 1,47 SCN (total) : 5,27 6,71 2,51 -          S.saprophyticus 3,67 4,67 1,74 -          Autres SCN 1,6 2,13 0,77 Enterococcus spp : 1,7 1,52 2,03 -          E.faecalis 1,13 1,02 1,35 -          Autres Enterocoques 0,57 0,51 0,68 Streptococcus spp : -          Streptococcus B 0,47 0,71 -         Autres Streptococcus spp 0,03 -Globalement les bactéries impliquées dans les IU de ville sont le BGN avec 91.7% et 88.3% sont des entérobactéries. -Les CGP représentent 8.3% des étiologies. -La fréquence selon l’espèce: E.coli largement en tête avec 62.37% suivi loin dernière avec K.pneumoniae (11.7%) P.mirabilis (7.63%) et les SCN avec 5.27% dont 69.62% sont des S.saprophiticus. En analysant les résultats en fonction du sexe on trouve, des différences partout aussi bien sur les groupes ou genre de bactéries que sur les espèces. 15

16 Espèces ou groupe d'espèces
Étiologies bactériennes et fongiques: Espèces ou groupe d'espèces Externes Hospitalisés BGN Entérobactéries Escherichia coli 62,37 35,66 Klebsiella spp* 11,7 15,33 P. mirabilis 7,63 6,33 Autres Proteus, 3,23 Morganella, Povidencia 2,66 Autres entérobactéries 3,9 7,32 BGN non fermentaires Acinetobacter spp 0,17 5 Pseudomonas spp 2,7 10,33  Cocci à Gram positif  S. aureus 0,83 1 SCN (total) : 5,27 -          S.saprophyticus 3,67 -          Autres SCN 1,6 Enterococcus spp : 1,7 1,33 -          E.faecalis 1,13 -          Autres Enterocoques 0,57 Streptococcus spp : 0,5 4,32 -          Streptococcus B 0,47 -          Autres streptococcus spp 0,03 Levures Candida albicans 3 Candida parasilosis 1,66 Candida kefyr 0,33 Non identifiées 16

17 Résistance des entérobactéries (ext) . Autres entérobactéries (214)
ATB Escherichia coli (1871) Klebsiella spp(351) Proteus mirabilis (229) Autres entérobactéries (214) Entérobactéries (2665) NB (R+I) AMP 1198 64.03 351 100 172 75.11 214 1935 72.61 PIP 1083 57.88 166 72.49 1814 68.07 TIC 1190 63.6 160 69.87 1915 71.86 AMC 275 14.7 75 21.37 69 30.13 128 59.81 547 20.53 CZ 622 33.24 122 34.76 86 37.55 156 72.9 986 37 IPM FOX 3 0.16 12 3.42 78 36.45 93 3.49 CTX 46 2.45 58 16.52 6 2.62 14 6.54 124 4.65 FEP 8 0.43 15 4.27 7 3.27 30 1.13 NA 225 12.03 53 15.1 34 14.85 50 23.36 362 13.58 OFX 117 6.25 11 3.13 148 5.55 CIP 51 2.73 5 1.42 2.18 4 1,86 65 2,43 AN 0.8 43 12.25 17 7.42 22 10.28 97 3.64 GM 41 2.19 57 16.24 137 5.14 NET 0.75 18 5.13 10 4,36 13 6,1 55 2,06 CS 45.33 197 7.39 C 174 9.3 14.53 4.8 286 10.73 FT 199 10.64 22.22 123 53,71 110 51,40 510 19,13 SXT 795 42.59 202 57.55 1161 43.56 SSS 935 49.97 217 61.82 92 40.17 40.19 1330 49.91 NI 268 14,32 56 15,95 14,84 42 19 ,62 400 FOS 60 3,2 3,41 3,49 7,94 3,65 17

18 F-DIAGNOSTIC BACTÉRIOLOGIQUE D’UNE INFECTION URINAIRE:
Rôle capital du labo de microbio dans le Dc et le suivi d’une IU . Celui-ci repose sur L’ECBU. Il consiste à : - Mettre en évidence et quantifier une leucocyturie et des éléments urinaires anormaux (cylindres, cristaux, levures, Trichomonas). - Mettre en évidence une bactériurie significative dans les urines. - Identifier et étudier la sensibilité de ces bactéries aux ATB. - Poser le Dc d’une IU ou d’une colonisation. - Distinguer une récidive d’un échec ou rechute. Orienter éventuellement la recherche vers un autre Dc (infection génitale, tuberculose urogénitale…) . Surveiller le Trt d’une IU compliquée . Étude génotypique en cas de suspicion d’épidémie d’IUN due à une même souche.

19 Eléments à maitriser pour la réalisation d’un ECBU correct :
Connaître les différentes circonstances anatomo-cliniques présidant à la réalisation d’un ECBU et influençant la conduite méthodologique. Procéder en toute circonstance au recueil aseptique des urines et garantir leur acheminement correct vers le laboratoire. Connaître les principales espèces microbiennes responsables d’infections du tractus urinaire afin de mieux les identifier. Savoir réaliser l’ECBU dans ses différentes étapes. Connaître les différents ATB utilisables dans les IU afin de composer le meilleur antibiogramme.

20 CIRCONSTANCES DE PRESCRIPTION D’UN ECBU :
Différentes circonstances peuvent conduire à la prescription d’un ECBU : Syndrome douloureux : Douleurs lombaires, douleurs pelviennes, brûlures mictionnelles (per, pré ou post), sensibilité au toucher rectal de la prostate (prostatite). Troubles fonctionnels de la miction : Dysurie, pollakiurie, incontinence urinaire, rétention urinaire, énurésie II aire chez l’enfant. Fièvre inexpliquée  : La température peut atteindre 39°-40°, elle représente dans ce cas un signe en faveur de la pyélonéphrite ou de la prostatite. Aspect anormal des urines : hématurie. Bandelette urinaire positive : Cas particulier du N/né et du nourrisson : Il n’existe aucun signe spécifique. Il faut savoir évoquer le Dc et faire un ECBU devant des signes cliniques parfois trompeurs : Fièvre variable (parfois très élevée, pouvant entrainer une convulsion inaugurale, mais souvent modérée ) ; septicémie surtout avant l’âge de 3 mois. Mauvaise prise de poids ou cassure de la courbe pondérale. Ictère persistant.

21 Colonisation nécessitant un Trt ATB:
ECBU systématique: déficience immunitaire, diabète, grossesse, chez les sujets ayant subit ou devant subir des manœuvres instrumentales ou une intervention chirurgicale portant sur l’appareil urogénital. Egalement avant un geste invasif à visée diagnostique ou thérapeutique (urétéro-cystographie rétrograde, cystoscopie, résection per endoscopique, manœuvre chez un porteur de prothèse…), en préopératoire (urologie, vasculaire, cardiaque, orthopédique).

22 3- ECBU : Prélèvements : Sujet adulte coopératif et enfant avec miction volontaire (cas général habituel) : fournir des renseignements précis oralement ou encore mieux sur un document d’information L’urine peut être recueillie à n’importe quel moment de la journée après au moins 4H sans miction ou au mieux lors de la première miction du matin, avant toute antibiothérapie. Après toilette locale (du gland prépuce relevé chez les patients de sexe masculin, du pourtour urinaire, des grandes et petites lèvres chez la femme) avec un antiseptique de type Dakin stabilisé ou plus simplement avec de l’eau savonneuse suivie d’un rinçage à l’eau, la première partie de la miction (environ 20ml) sera rejetée, permettant d’éliminer tout ou partie de la flore commensale de l’urètre antérieur, et seul le milieu du jet (20-30ml) sera recueilli dans un récipient stérile. Le prélèvement est effectué en écartant les grandes lèvres chez la femme et le prépuce chez le patient de sexe masculin non circoncis afin d’éviter souillure et contamination. Chez la femme qui présente des pertes, même minimes, la mise en place d’une protection vaginale et indispensable.

23 Sujet adulte non coopératif ou incontinent :
Sujet adulte non coopératif ou incontinent : Le recueil chez la femme sera réalisé par sondage urinaire à l’aide d’une sonde de petit calibre. Cette manœuvre est à éviter chez l’homme car pourvoyeuse de prostatites et on lui préférera le recueil par collecteur pénien, voir par ponction sus-pubienne en cas de rétention d’urine La ponction sus-pubienne de la vessie est un acte médical nécessitant des conditions d’asepsie optimales. Elle est difficilement utilisable en pratique courante et doit par ailleurs être faite par un praticien entrainé. Après désinfection soigneuse des téguments, ponctionner directement l’urine dans la vessie à l’aide d’une seringue montée.

24 Chez le petit enfant sans miction volontaire, nourrisson, N/né :
Après un nettoyage soigneux de la région périnéale on utilise une poche plastique stérile qui ne doit pas être laissée en place plus de 30 mn. Au-delà de ce temps, on place une nouvelle poche après avoir recommencé le nettoyage. Pour les anglo-saxons ce mode de prélèvement est entaché d’un taux inacceptable de faux positifs (> 50%). Aussi toute analyse d’urine issue de ce mode de prélèvement, suggérant la présence d’une IU devrait être confirmée par la réalisation d’un sondage, chez la fille ou d’une ponction sus pubienne chez le garçon. L’urine peut également être saisie « à la volée » au moment du change .

25 Patient sondé à demeure: Chez le patient porteur de sonde urinaire, il ne faut en aucun prélever dans le sac collecteur ou la pullulation bactérienne est importante mais par ponction directe dans la sonde. Il ne faut pas déconnecter le système de drainage qui doit rester fermé. Le tuyau d’évacuation sera clampé pendant 10 mn afin de laisser l’urine s’accumuler en amont puis l’urine sera ponctionnée via l’opercule spécifique de la sonde après désinfection à l’alcool iodée. Ce type de prélèvement pratique, ne reflète cependant pas toujours la ou les espèces bactériennes présentes dans la vessie mais plutôt les espèces colonisant la sonde urinaire. C’est pourquoi dans toute la mesure du possible, on privilégiera le prélèvement juste après un changement de sonde . Urétérostomie (sans sonde) : Après nettoyage soigneux de la stomie on met en place un collecteur stérile et l’on procède comme pour le nourrisson.

26 Epreuve de MEARS et STAMEY : L’épreuve de MEARS et STAMEY comprend un recueil des urines en 2 phases avant et après massage prostatique et 4 prélèvements : VB1 (Voiding Bladder) correspond aux 10 premiers ml d’urine: bactéries de la colonisation urétrale. VB2 Urines du milieu de la miction : bactéries des urines vésicales. Le massage prostatique réalisé ensuite permet la récupération au méat urétral de sécrétions (soit directement, soit par écouvillonnage) qui sont le reflet de l’atteinte prostatique ; la mise en culture de ces sécrétions (ou EPS, expressed prostatic secretion) doit être fait en extemporané. VB3 consiste à recueillir les 10 premiers ml d’urines éliminés après le massage prostatique ; cela correspond au lavage de l’urètre prostatique par les urines vésicales et peut être le reflet de la colonisation bactériologique de la prostate.

27 - La technique du milieu du jet
Recueil des urines Il existe plusieurs techniques de prélèvement adaptées à l’âge et à l’état du malade, mais toutes doivent être soumises aux conditions d’asepsie rigoureuse. - Sachet collecteur - La ponction sus pubienne - La technique du milieu du jet - Etui pénien - Sondage vésical ou Cathétérisme vésical

28 Transport et conservation du prélèvement :
Transport au laboratoire en moins de 2H. Au-delà de ce délai, conservation à 4°C ( la réfrigération ne préserve pas les leucocytes). Un autre moyen permettant d’empêcher toute prolifération bactérienne : agent bactériostatique sous forme de poudre comme l’acide borique ( conservation des urines à température ambiante pendant 24 H sans modification notable du taux de bactéries et sans altération des leucocytes. Ce système, simple mais plutôt onéreux (indications du fabricant afin d’obtenir la concentration optimale du conservateur). L’acide borique est susceptible de diminuer la sensibilité de la recherche de leucocyte estérase par BU .

29 Renseignements accompagnant le prélèvement :
Ces renseignements sont indispensables car ils permettront au microbiologiste d’optimiser l’ECBU et son interprétation. Ils concernent l’âge et le sexe du patient, le mode et l’heure du prélèvement, les motifs de la demande, les antécédents d’IU, la notion de maladie concomitante, le Trt éventuellement prescrit

30 TECHNIQUES D’ANALYSE :
Examen macroscopique : Urines normales: généralement jaunes claires et limpides. Urine trouble: suggère une IU, mais n’est cependant pas spécifique, elle peut être liée à la présence de cristaux, de médicaments, etc. -L’examen macroscopique permet donc d’apprécier la limpidité et de noter la présence d’une éventuelle hématurie. Seulement 5% des urines infectées sont limpides.

31 Examens microscopiques:
Etude cytologique : La numération des leucocytes et éventuellement des hématies se fait par examen microscopique à l’EF en cellule de Malassez (1mm3) ou de préférence en cellule de Nageotte (40mm3) sur des urines homogénéisées. L’EF peut éventuellement être complété par un examen après coloration au BM. Le résultat est exprimé en hématies et leucocytes par mm3 ou par ml. Le seuil de significativité de la leucocyturie est remarquablement consensuel, fixé dans tous les écrits à >= 10/mm3, soit >= 104 /ml. Il faut cependant noter que ce critère peut manquer dans de rares cas d’authentiques IU et qu’au contraire une leucocyturie « significative » n’a aucune valeur chez le patient sondé à demeure chez lequel elle peut simplement correspondre à l’inflammation de l’urothelium provoquée par l’action mécanique du dispositif . A l’état physiologique, l’urine contient moins de 5000 hématies par ml. En cas d’IU, le processus inflammatoire se traduit le plus souvent par la présence de : - Plus de 50 leucocytes par mm3, parfois en amas. - Plus de 10 hématies par mm3 témoins de microhémorragies . Il faut également préciser que 20% des femmes asymptomatiques présentent une leucocyturie supérieure ou égale à 20 leucocytes par mm3 du fait d’une contamination vaginale . Toute stase urinaire s’accompagne de phénomènes inflammatoires responsables de l’élévation de la leucocyturie. Tout segment intestinal (iléo-urétéroplastie, iléo-cytoplastie, Briker, agrandissement de la vessie…) laisse passer les leucocytes dont la numération devient ininterprétable.

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34 Le comptage des leucocytes par champ microscopique est moins fiable
Le comptage des leucocytes par champ microscopique est moins fiable. L’estimation sans numération ne doit plus être utilisée. A titre indicatif nous rapportons ci-dessous l’équivalence des différentes méthodes de quantification. Equivalence des différentes méthodes de quantification des leucocytes . *L= leucocytes. **Champs de x 40 L/mm3= 1000 L/ml. +/= Très rares < 5L*/mm3 1L tous les 3-4 champs** +/- Rares 5-10 L/mm3 1L tous les 1-2 champs + Quelques 10-25 L/mm3 1-2 L/champs ++ Assez nombreux L/mm3 5-10 L/champs +++ Nombreux L/mm3 10-50 L/champs ++++ Très nombreux >500 L/mm3 Nappe de leucocytes

35 Les cellules ne sont pas toutes d’origine vésicale
Les cellules ne sont pas toutes d’origine vésicale. On doit distinguer les lymphocytes et les polynucléaires (souvent altérées et en amas). On rencontre aussi des cellules rondes rénales, des cellules en raquettes de la couche moyenne de l’épithélium vésical, de grandes cellules à petits noyaux d’origine vaginale (signe une contamination et entraine le rejet de l’examen). De plus l’examen microscopique à l’EF permet de mettre en évidence la présence : de cylindres : les cylindres ont pour origine la lumière tubulaire rénale. Ils peuvent être hyalins et sont alors principalement composés de la protéine de Tamm Horsfall qui est une défensive de l’arbre urinaire, ces cylindres sont physiologiques. Les cylindres hématiques et/ou leucocytaires pathologiques . Leur présence permet d’identifier le rein comme la source de l’hématurie et ou de la leucocyturie . de cristaux médicamenteux, d’oxalates de calcium, d’acide urique, phospho-amoniaco-magnésien. Ces derniers signent la présence d’une lithiase secondaire à une infection liée à une bactérie productrice d’uréase (notamment Proteus mirabilis, Corynebacterium urealyticum) et qui provoquent une alcalinisation des urines. de levures, Trichomonas, spermatozoïdes, œufs de parasites (Schistozoma haematobium) ou bactéries.

36 Les cylindres granuleux
Les cylindres hyalins Les cylindres érythrocytaires Les cylindres leucocytaires

37 Les cristaux urinaires
Oxalates de calcium Les phosphates amorphes et les triple phosphates ou phosphates ammoniacaux Acide urique et urates amorphes

38 Examen direct après coloration : L’ED après coloration de Gram d’une goutte d’urine non centrifugée, permet de noter la présence ou non d’une flore bactérienne, son caractère monomorphe ou polymorphe et précise l’affinité tinctoriale des éléments bactériens. -valeur d’orientation, -très dépendant de l’expérience de l’opérateur. Le seuil de détection est de 5 x 104/ml (l’absence de bactérie à l’ED n’exclut nullement le Dc). - l’ED d’une urine non centrifugée ne présente une sensibilité proche de 100% que pour des concentrations bactériennes > 105 UFC/ml . Son intérêt réside tout particulièrement dans les IUN où les IU à BU négatives pour les nitrites (recherche de bactéries Gram positives pouvant modifier le choix ATB). En fonction des microorganismes présents, cet examen peut avoir également un intérêt dans le choix des milieux de culture

39 Milieux non chromogènes :
MISE EN CULTURE : Choix des milieux : Milieux non chromogènes : La grande majorité des bactéries responsables d’infections urinaires ne sont pas exigeantes et sont cultivées sur géloses ordinaires. Caractères des milieux non chromogènes pouvant être utilisés. Gélose nutritive GN : Milieu non sélectif, non inhibiteur, sans indicateur coloré. La différenciation des colonies est difficile. CLED : Cystéine, lactose, électrolyte-déficient. Milieu peu sélectif. Indicateur coloré (Bleu de bromothymol) de variation de pH après consommation du milieu (lactose) par les bactéries. L’aspect des colonies oriente vers l’identification des germes mais le Dc présomptif devra toujours être confirmé par une identification biochimique complète. Inhibition de l’envahissement de Proteus par la faible teneur en électrolytes. BCP : Gélose lactosée au Bromo Crésol Pourpre. Milieu non sélectif non inhibiteur.

40 Gélose Mac conkey : Milieu sélectif. Gélose lactosée au rouge neutre (indicateur de pH coloré mettant en évidence la fermentation du lactose par les bactéries). La présence de sels biliaires évite l’envahissement par Proteus et de cristal violet inhibant la croissance des germes à Gram positif. Hectoen : Milieu sélectif pour l'isolement et la différenciation des bacilles à Gram négatif. La fermentation d'au moins un des sucres se traduit par une coloration "saumon" des colonies. L'absence de fermentation se traduit par une coloration bleue ou verte des colonies. La production d’hydrogène sulfuré (H2S) est caractérisée par des colonies à centre noir. Inhibition de l’envahissement par les Proteus. Gélose au sang : Milieu d’enrichissement, sans indicateur coloré. Convient pour la culture des germes exigeants et hémolytiques. L’association acide nalidixique + colimycine (ANC) inhibe les bactéries Gram négatif et les bacillus. Milieu adapté à la culture des bactéries Gram positif notamment les streptocoques.

41 Milieux chromogènes : Principe : Le principe du milieu chromogène est d’utiliser des substrats synthétiques qui sont des analogues structuraux d’une molécule naturellement clivée par une enzyme caractéristique d’une espèce bactérienne ou d’un groupe d’espèces bactériennes. Le substrat clivé acquiert des propriétés chromogéniques et précipite en colorant la colonie sans diffuser dans la gélose. La plupart des milieux chromogènes utilisent un jeu de différents substrats permettant une très bonne différenciation des colonies et une identification présomptive de ou des espèces bactériennes présentes dans l’urine

42 Milieux chromogéniques
Ensemencement par technique à l’anse calibrée de l’urine sur des milieux gélosés contenant des chromogènes. Mise en évidence de certains genres et espèces bactériennes grâce à l’aspect des colonies. Le principe du milieu chromogène est d’utiliser des substrats synthétiques qui sont des analogues structuraux d’une molécule naturellement clivée par une enzyme caractéristique d’une espèce bactérienne ou d’un groupe d’espèces bactériennes. Le substrat clivé acquiert des propriétés chromogéniques et précipite en colorant la colonie sans diffuser dans la gélose. La plupart des milieux chromogènes utilisent un jeu de différents substrats permettant une très bonne différenciation des colonies et une identification présomptive de ou des espèces bactériennes présentes dans l’urine

43 Ensemencement : L’ensemencement doit répondre au double but de dénombrer les bactéries et d’isoler la ou les bactéries en cause en obtenant des colonies bien distinctes les unes et les autres Méthode de KASS (méthode de référence) : On fait des dilutions de 10 en 10 (1/10, 1/100, 1/1000) en eau distillée stérile. Un volume connu (0.1ml) des différentes dilutions est étalé sur une boite de pétri (habituellement une gélose nutritive) avec un râteau préalablement stérilisé. Chaque bactérie ou amas de bactéries présents dans l’urine donne naissance à une colonie visible à l’œil nue (UFC). Le nombre de bactéries par millilitre est apprécié en comptant le nombre d’UFC sur la gélose puis en le rapportant au volume d’urine ensemencée et à la dilution correspondante. Méthode de VERON :L’urine est diluée au 1/100ème, seulement en eau distillée stérile. On étale 0.1ml de cette dilution. Une colonie correspond à 1000 bactéries par millilitre

44 Méthode de l’anse calibrée (avec ou sans milieu chromogène) :
Mise en culture du milieu chromogène ou à défaut d’une gélose nutritive : -Homogénéiser le prélèvement par agitation. -Ensemencer le milieu qui permet, dans le cas du milieu chromogène, la numération et l’identification des principaux germes urinaires en une seule étape. L’ensemencement est réalisé à l’aide d’une anse calibrée stérile à 10 µl : immerger l’anse dans l’urine en la tenant verticalement ; décharger le contenu de cette anse en appuyant la boucle sur le haut de la gélose ; tirer de ce point une verticale jusqu’au milieu de la boite ; sans recharger l’anse, faire des stries perpendiculaires serrées en partant du point de dépôt puis des stries plus larges à partir du milieu de la gélose pour avoir un bon isolement des colonies. -L’ensemencement peut être également fait par 4 ou 5 stries parallèles horizontales. -Lecture et numération : Le compte des germes est réalisé en dénombrant les « unités formant colonies » (UFC) sur la gélose et en comparant la densité des colonies présentes à celle du schéma fourni par le fabricant (pour les milieux chromogènes).

45 4 . CULTURE Techniques d’ensemencement 1 - Méthode de référence : Méthode de KASS Modifiée 3 - Lames immergées 2 - Méthode à l’anse calibrée

46 Méthode de la lame immergée
On plonge dans l’urine fraichement émise une lame portant des milieux nutritifs, généralement Mac Conkey . Cette méthode permet d’ensemencer les urines au lit du malade et limite les risques d’erreurs liées aux mauvaises conditions de transport. Cependant elle présente le désavantage de ne pas obtenir des colonies isolées pour des concentrations de 106 bactéries et plus/ ml et donc nécessite souvent le réensemencement en isolement en cas d’infection.

47 Techniques à base de milieux chromogéniques
Ensemencement par technique à l’anse calibrée de l’urine sur des milieux gélosés contenant des chromogènes. Mise en évidence de certains genres et espèces bactériennes grâce à l’aspect des colonies. Le principe du milieu chromogène est d’utiliser des substrats synthétiques qui sont des analogues structuraux d’une molécule naturellement clivée par une enzyme caractéristique d’une espèce bactérienne ou d’un groupe d’espèces bactériennes. Le substrat clivé acquiert des propriétés chromogéniques et précipite en colorant la colonie sans diffuser dans la gélose. La plupart des milieux chromogènes utilisent un jeu de différents substrats permettant une très bonne différenciation des colonies et une identification présomptive de ou des espèces bactériennes présentes dans l’urine

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50 Méthode de la lame immergée :
On plonge dans l’urine fraichement émise une lame portant des milieux nutritifs, généralement Mac Conkey et CLED. Cette méthode permet d’ensemencer les urines au lit du malade et limite les risques d’erreurs liées aux mauvaises conditions de transport. Cependant elle présente le désavantage de ne pas obtenir des colonies isolées pour des concentrations de 106 bactéries et plus/ ml et donc nécessite souvent le réensemencement en isolement en cas d’infection. Cout élevé

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52 Appareils et méthodes automatiques :
Il existe différents automates permettant de cribler en moins d’une demi-heure les urines et de déterminer les échantillons à ensemencer. Différents technologies ont été développées. La microscopie à flux couplée à un système d’analyse d’image (IRIS IQ200), soit à un système de marquage fluorescent (Sysmex UF-100) permettant non seulement le compte de bactéries mais aussi celui des leucocytes, des hématies et la détection des cristaux et des levures. La technologie de l’automate Cellenium-160US repose sur l’utilisation d’une sonde fluorescente marquant l’ensemble des bactéries qui sont détectées et dénombrées par un microscope à fluorescence. Le « Coral UTI Screen system » repose sur la quantification de l’ATP bactérien par fixation sur la luciférine et émission de la lumière après action de luciférase. Tous ces automates ont pour inconvénient d’être cher à l’achat et ne peuvent être utilisés que par les laboratoires traitant plusieurs centaines d’échantillons d’urines par jour. Les échantillons détectés positifs doivent être secondairement ensemencés. Le facteur coût est encore plus vrai en Algérie ou la main d’œuvre est moins chère que dans les pays occidentaux.

53 Incubation des urocultures :
La majorité des bactéries des infections urinaires poussent en 18 à 24 heures. Lorsque la culture bactérienne est négative alors que des bactéries ont été vues à l’ED ou que le résultat ne correspond pas au contexte clinique on doit prolonger l’incubation de 24 H surtout quand des urines sont obtenues par des techniques invasives. Si les cultures s’avèrent négatives après 48H demander un autre examen et en cas de confirmation de la présence de bactéries au Gram il faut suspecter des bactéries déficientes (du faite d’une antibiothérapie) ou inhabituelles : Haemophilus, Streptocoques déficients, Corynebacterium, voire anaérobie (en cas de fistule colo vésicale). Il faut alors utiliser des milieux de culture appropriés (gélose au sang incubée en anaérobiose durant 48 heures et une gélose « chocolat » sous CO2 durant 48heures). Quand la recherche d’anaérobie est demandée, elle doit être faite sur urine obtenue par PSP .

54 Interprétation des urocultures :
Interprétation de la bactériurie quantitative sur échantillons obtenus par la technique du « milieu du jet » : Critères de KASS (1957) : IU à 105 UFC/ml ( trop restrictifs). STAMM et al ont montré que le titre bactérien des urines vésicales recueillies par ponction sus-pubienne est inférieur à 105 UFC/ml chez 1/3 des patients présentant une symptomatologie de cystite aigue avec leucocyturie et bonne réponse clinique au Trt ATB, certaines patientes présentant un titre aussi faible que 102 UFC/ml et laissées sans Trt, vont développer en quelques jours un compte > 105 UFC/ml . Ils ont démontré également en réalisant une étude chez des femmes présentant une cystite, qu’une observance stricte des critères de KASS pouvait entrainer le rejet à tort de Dc d’IU pour 50% des cas. Dans cette étude, le taux de bactériurie seuil permettant d’inclure 95% des cystites, était de 103 UFC/ml. Par ailleurs il a été montré que dans de grandes séries de PNA à hémocultures positives que la bactériurie s’établissait à plus de 105 UFC/ml chez 80% des malades, à 104 UFC/ml chez 10 à 15% et à 103 UFC/ml ou moins chez 5 à10% des patients.

55 Infections communautaires Cystite aigue KASS et coll (1957)
Différents seuils de significativité de la bactériurie en fonction des références. Référence Infections communautaires Cystite aigue PNA KASS et coll (1957) >= 105 UFC/ml RUBIN et coll (1992) >=103UFC/ml >=104UFC/ml ANDEM (1996)  >=103UFC/ml si coliforme >= 105 UFC/ml si autre germe

56 Représentation bimodale des bactériuries quantitatives .
En fait schématiquement les bactériuries quantitatives évoluent selon une courbe bimodale : Représentation bimodale des bactériuries quantitatives . Il existe une zone imprécise ou on trouve à la fois des sujets non infectés et des sujets infectés. La décision dépendra du contexte clinique, de la leucocyturie et du germe en cause. Une bactériurie < 105 UFC/ml peut être significative dans plusieurs circonstances : Germes à croissance lente (Staphylococcus saprophyticus, Candida,…) Infection débutante. Localisation prostatique. Diurèse abondante. Mictions fréquentes. Urines acides. Présence dans les urines de substances antibactériennes (ATB, urée augmentée, ….). Toutes ces considérations ont conduit à une révision du seuil de la bactériurie dans les référentiels. Il est admis que sous respect strict des conditions de prélèvements, de transport et d’analyse des urines, toute bactériurie > 103 UFC/ml est à prendre en considération .

57 Le groupe I : Le groupe II :
Un groupe de microbiologistes Européens a proposé un classement en catégories des germes retrouvés en culture dans les ECBU en fonction de leur niveau d’implication dans l’étiologie des IU : Le groupe I : Les bactéries de ce groupe sont des uropathogènes reconnus même en faible quantité (>= 103 UFC/ml : Escherichia coli, Staphylococcus Saprophyticus (essentiellement chez la femme jeune), Salmonella (rare), Mycobactéries (rare)). Le groupe II : Ce groupe comprend des bactéries moins fréquemment responsables d’IU. Ces infections sont plus souvent d’origine nosocomiale lorsqu’il existe des facteurs anatomiques ou iatrogènes favorisants. Un taux de 104 UFC/ml est proposé pour les bactéries de ce groupe qui comprend : Les autres entérobactéries (Klebsiella spp, Proteus spp, Enterobacter spp, Morganella spp) ; Enterococcus spp Pseudomonas aeruginosa. Staphylococcus aureus. Corynebacterium urealyticum. Haemophilus spp (rare). Streptococcus pneumoniae (rare) :

58 Le groupe III : Le groupe IV :
Leur implication en pathologie exige un niveau de bactériurie élevé (>= 105 UFC/ml), une répétition de leur isolement sur au moins deux échantillons d’urine et si possible des critères cliniques ou d’inflammation. Streptococcus agalactiae ; Candida spp (Candida albicans, Candida glabrata) ; Les staphylocoques à coagulase négative (autre que S.saprophyticus) ; Acinetobacter baumannii ; Stenotrophomonas maltophila ; Burkholderia cepacia ; Oligella urethralis ; Aerococcus urinae ; Le groupe IV : Ce sont les bactéries de la flore urétrale ou génitale de proximité pour lesquelles l’identification et l’antibiogramme ne doivent pas être réalisés en routine. Ces bactéries sont : Streptocoques alpha hémolytiques ; Gardnerella vaginalis ; Lactobacillus spp ; Bacillus coryneformes (à l’exception de C.urealyticum) ; Seul leur isolement à partir d’une ponction sus-pubienne peut permettre d’évoquer leur rôle pathogène.

59 Interprétation de la bactériurie quantitative sur échantillons obtenus par une technique différente : Les taux de bactériurie significatifs varient selon le mode de prélèvement. Il est a noté que pour une ponction sus-pubienne, le taux est de 10 UFC/ml et nécessite donc l’ensemencement de 100µl.

60 Cas particulier de la bactériurie asymptomatique ou colonisation :
La bactériurie asymptomatique peut survenir avec ou sans leucocyturie. Sa fréquence chez la femme jeune est inférieure à 1% mais elle peut dépasser 10% chez les patients de plus de 80 ans, les diabétiques, les patients ayant une vessie neurologique, les hémodialysés et les patients sondés de façon intermittente ou à demeure. Toutefois la recherche de bactériurie asymptomatique n’est connue comme apportant un bénéfice réel que dans deux contextes cliniques particuliers. Au cours de la grossesse, la bactériurie asymptomatique représente un risque accru de survenu de pyélonéphrite et d’accouchement prématuré et doit être systématiquement recherché au cours du 1er trimestre. De même, en prévision d’une intervention sur les voies urinaires et notamment d’une résection trans-urétrale de la prostate ou de l’ablation d’une sonde JJ, une bactériurie asymptomatique sera systématiquement recherchée et traitée afin de prévenir un risque accru de sepsis

61 Interprétation des discordances entre leucocyturie et bactériurie :
Contextes cliniques au cours desquels sont observées des discordances entre leucocyturie et bactériurie. leucocyturie sans bactériurie bactériurie sans leucocyturie -Lors d’un traitement antibiotique préalable (infection suspectée). -Patient neutropenique. -Lors d’une urétrite, vaginite, de leucorrhées abondantes. -En cas d’infection par des bactéries ne donnant pas des cultures sur les milieux standards (mycobactéries, mycoplasmes, gonocoques, anaérobies, microorganismes intracellulaires tels Chlamydia trachomatis). -Jeune nourrisson. -Lors d’une maladie systémique fébrile. -Début d’infection. -En cas d’urines concentrées par déshydratation. -Lors d’une irritation liée à la présence d’un cathéter. -En présence de calculs ou de corps étrangers dans les voies urinaires. -Femme enceinte. -Au cours d’une appendicite, d’une glomérulonéphrite aigue ou d’une néphrite interstitielle par antalgiques. -En cas de gastroentérite. -Lors d’une infection non bactérienne (Candida spp).

62 Identification et antibiogramme :
Identification et antibiogramme effectué en parallèle en testant les ATB qui ont une bonne élimination urinaire en particulier : β-lactamines, quinolones, furanes, cotrimoxazole, aminosides, fosfomycine. INTERPRÉTATION DE L’ECBU : En théorie, l’interprétation de l’ECBU s’effectue en prenant en compte les paramètres suivants : Bactériurie quantitative et qualitative : < 103 UFC/ml : absence de bactériurie significative. > 105 UFC/ml : infection probable. Entre 103 et 105 UFC/ml : c’est la zone d’incertitude qui varie selon l’espèce bactérienne, l’expression des signes cliniques d’IU et selon le fait que le patient soit sondé ou non. Eventuellement ces valeurs peuvent être recontrolées sur un autre échantillon d’urines. Certaines conditions de prélèvement des urines permettent d’abaisser encore ces seuils (prélèvement effectué par ponction sus-pubienne : bactériurie significative >= 102 UFC/ml.).

63 Leucocytes : La leucocyturie n’est pas toujours prise en considération de même qu’elle peut être absente dans certains cas d’IU. En pratique, ces critères (bactériurie et leucocyturie), nécessaires mais non obligatoirement suffisants, doivent être discutés au cas par cas en y intégrant les paramètres complémentaires suivants : Les symptômes évocateurs d’infection urinaire : dysurie, pollakiurie, pesanteur vésicale, hématurie macroscopique, incontinence urinaire, douleurs lombaires, hyperthermie (>= 38°C). Les conditions de prélèvements et de transport. Le caractère mono ou pluri microbien des cultures. Les résultats d’ECBU précédents.

64 Contextes particuliers : Leucocyturie amicrobienne :
-Tuberculose :Toute leucocyturie sans bactéries doit faire évoquer une tuberculose rénale. En fonction du contexte une recherche des mycobactéries sera réalisée ou conseillée, sur six prélèvements à des jours différents. -Infection génitale :Au même titre que la tuberculose, il faut penser à éliminer une infection génitale et encore plus une infection sexuellement transmise (IST) par l’interrogatoire, l’examen clinique et si nécessaire des prélèvements chez le ou la patiente et le ou les partenaires sexuels.

65 Colonisation : La colonisation urinaire n’est pas une indication thérapeutique quelles que soient les comorbidités du patient (sonde, diabète, âge, vessie neurologique) sauf dans de rares circonstances : - Neutropénie, immunodépression. - Grossesse. - En pré-opératoire (urologie, vasculaire, cardiaque, greffe). - En pré-manoeuvre chez un porteur de prothèse. - Greffe rénale. 

66 Patients immunodéprimés :
La survenue d’une cystite hémorragique chez un patient immunodéprimé ou un patient âgé ou un patient ayant subi une intervention urologique doit faire évoquer une infection à Corynebacterium urealyticum responsable de cystite dite « incrustante ». Cette suspicion pourra être confortée par la présence de cristaux type phosphate amonioco magnésiens ou un pH urinaire alcalin. Les urines devront être ensemencées sur gélose au sang et l’incubation sera prolongée au moins 48h. Cette corynebactérie a de plus la particularité d’être multi résistante. Les levures poussent habituellement bien sur les milieux chromogènes en 24h. Toutefois un milieu type Sabouraud ou chromogène pour levure sera ensemencé en présence de levures à l’ED et en cas de suspicion clinique d’IU avec urine stérile .

67 VALIDATION ET SORTIE DU RÉSULTAT :
Les résultats définitifs devront être accompagnés de commentaires clairement rédigés ; ils devront dans certains cas susciter le dialogue avec le clinicien. Certaines remarques sont fréquentes : Concernant le mode de prélèvement, en cas de souillure, il faut rappeler les règles strictes du prélèvement. L’ECBU est un des rares examens bactériologiques répétitifs. En cas d’interprétation  litigieuse il faut le signaler au médecin prescripteur et il ne faut pas hésiter à demander un autre prélèvement (protocole de prélèvement écrit). Les bactéries telles que Pseudomonas, Acinetobacter, Serratia, signent une IU iatrogène. Parfois l’antibiogramme n’est fourni qu’à titre indicatif, il faut alors souligner que ce n’est pas une incitation à l’antibiothérapie.

68 Résultats globaux (%) de l’examen direct des urines.
DIAGNOSTIC RAPIDE PAR EXAMEN DIRECT: Résultats globaux (%) de l’examen direct des urines. Sensibilité Spécificité VPP VPN Bactéries 89.14 80.45 46.37 97.76 Leucocytes 75.78 82.17 39.91 95.09 Bactéries et leucocytes 95.6 91.88 65.41 99.23 Absence de bactérie Excellente VPN , proche de 100% quelque soit le sexe ou l’origine du Leucocytes < ou = 10/mm3 Prlvt VPP médiocre , la plus faible est observée chez le nourrisson ( 42,85%)  attirer l’attention du prescripteur. L’application de l’ED permet d’arrêter l’analyse dans 51,55% des cas pour « absence de signes bio d’IU ».

69 Application:Privilégier l’ED en laboratoire de microbiologie Etant donné son excellente VPN son application permet, lorsqu’il est négatif: -l’arrêt de plus de la moitié des examens demandés pour « absence de signes biologiques d’infection urinaire » (Dc rapide) -économie de plus de 50% des cultures. -permet au prescripteur d’envisager sans perte de temps, un Dc différentiel. Un ED positif, en raison de la VPP médiocre particulièrement chez le nourrisson et les patients de sexe féminin, doit être accompagné, lorsqu’il est rendu , par un commentaire type « Cet examen direct n’est pas significatif d’infection, il est nécessaire d’avoir le résultat de la culture pour son interprétation ».

70 SURVEILLANCE DE L’IU PAR LE LABORATOIRE :
Au cours du Trt, si l’IU est liée à une bactérie usuelle sans résistance particulière il n’y a pas lieu de redemander un ECBU après 48h de Trt ni au-delà, sauf en cas d’évolution défavorable (reprise de la fièvre, douleurs….). La stérilisation des urines est rapide (<48h). Le retour à la normale de la leucocyturie est plus lent et peut nécessiter 5 à 7 jours. L’ECBU est recommandé à la suite: d’un Trt court, au plus tôt une semaine après la prise médicamenteuse (dose unique ou Trt de 3 jours). Il est nécessaire en cas d’échec clinique évident ou de suspicion de récidive. En cas d’atteinte tissulaire, d’IU sur terrain immunodéprimé ou diabétique, de la présence d’une anomalie urologique, chez la femme enceinte, Un ECBU peut éventuellement être pratiqué 3 jours après le début d’un Trt pour vérifier l’efficacité bactériologique et la stérilisation des urines dans les IUC mais un ECBU de contrôle post thérapeutique à distance de la fin du Trt est toujours nécessaire (4 à 6 semaines). Lors des contrôles, quatre situations peuvent être rencontrées : Guérison sans réinfection. Réinfection avec une bactérie caractérisée différente par le laboratoire. Echec (absence de stérilisation initiale lors du contrôle pendant le Trt). Rechute (stérilisation initiale puis reprise de l’IU découverte lors du contrôle à distance de la fin du traitement). La persistance de la bactériurie (échec ou rechute) peut être due à une antibiothérapie insuffisante ou mal adaptée, à une résistance bactérienne non détectée à l’origine ou acquise en cours de Trt. La réponse à ces questions suppose la conservation des souches isolées pendant une durée d’au moins 6 mois à un an.