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Différenciation endothéliale et processus angiogéniques Pr Philippe NGUYEN EA3801 et Laboratoire dHématologie Université de Reims Champagne Ardenne CHU.

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1 Différenciation endothéliale et processus angiogéniques Pr Philippe NGUYEN EA3801 et Laboratoire dHématologie Université de Reims Champagne Ardenne CHU de Reims EA3801

2 Cellule endothéliale Cellules aplaties (L:100 µm-l:10 µm Épaisseur :0,3 µm) disposées en mosaïque - Corps de Weibel Palade (ME) - Facteur Willebrand - PECAM1 (CD31) / VE-Cadhérine (CD144) - Synthèse de NO (eNOS) - JAMS/Esélectine/VEGFR2 1 à cellules Poids total : 1 kg Surface : 1 à 7 m2

3 Angiogénèse ANGIOGENESE POST-EMBRYONNAIRE, NON TUMORALE : angiogénèse : prolifération capillaire, favorisant le flux sanguin vasculogénèse : à partir de progéniteurs endothéliaux artériogénèse : développement des réseaux collatéraux (résistance) Hypoxie Migration / Prolifération Différenciation HIF-1 Facteurs de croissance/Cytokines VEGF, FGF, IGF …

4 Cellule progénitrice endothélial : – endothelial progenitor cell (PEC) –Différenciation et acquisition dun phénotype endothélial à partir dune cellule souche hématopoïétique CD34+ [Asahara, 1997] –Circulating bone marrow-derived endothelium progenitor cells (CEPCs) [Rafii, 1998] : CD34+ Marqueurs phénotypiques : facteur von Willebrand, Dil-Ac-LDL.

5 Sang de cordon 1. Isolement des PBMC 3.Tri immuno-magnétique des cellules CD34 positives 2. Élimination des cellules adhérentes 4.Mise en culture dans des « conditions endothéliales » (VEGF …) Isolement des cellules CD34+

6 Analyse de lexpression membranaire et moléculaire à différent temps de la différenciation: VEGF, VEGFR1,VEGFR2,CD144(VE-cadhérine), et FT Modèle de différentiation des cellules CD34+ en progéniteurs endothéliaux (PEC) Cellule souche CD34+ Progéniteurs endothéliaux J0 J25-30 Facteurs de croissance (VEGF…)

7 Caractérisation des PEC Culture cellulaire –À partir de sang de cordon, de sang périphérique –Support : gélatine, fibronectine, collagène de type I –Facteurs de croissance : VEGF, IGF-1, EGF, FGF-B –Temps dobtention –Aspect des colonies : Cellules adhérentes « spindle shaped » Tapis de cellules fusiformes précoces tardives

8 Phénotype des PEC CD133 (AC133) : –Exprimé par la CSH –Absent de la cellule endothéliale mature et du monocyte –Différenciation endothéliale in vitro CD34 : –marqueur de cellule souche hématopoïétique –Présent (faible expression) sur la cellule endothéliale mature VEGF-R2 (KDR) : –Marqueur endothélial

9 VEGFR2 EPC HUVEC CD34 Count CD34 EPC HUVEC Count Phénotypage des PEC par cytométrie en flux CD34 : PBMC de sang de cordon PEC : en milieu de culture adapté HUVEC : Cellules endothéliales matures EA3801

10 Origine (multiple) des précurseurs endothéliaux HSC Progéniteurs Myéloïdes Progéniteurs Endothéliaux Hémangioblaste Monocyte

11 Progéniteurs endothéliaux circulants Monocyte PEC CD14+ CD14+,CD34low, KDR+ Sous-type myéloïde CD34+, CD133+, KDR+ « True angioblast » PEC CD34+ Leri, Circ Res 2005

12 Origine et différenciation des progéniteurs endothéliaux, daprès Dimmeler, 2004.

13 Mesure de la prolifération Expansion Migration cellulaire Formation de tubes : (Matrigel)Formation de tubes : (Matrigel) Activité paracrine : – synthèse de facteurs de croissance : VEGF, HGF, G-CSF, GM-CSF Modèles animaux : –Implant de Matrigel –Modèle dischémie de la patte (ligature de lartère fémorale) Caractérisation des PEC Rehman, 2003 ; Hur, 2004 X 40

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15 Sources possibles de cellules endothéliales –Cellules souches : CSH, cellules souches « cardiaques », cellules souches mésenchymateuses, –Cellules myéloïdes : CD14+/VEGF-R2+ CD34-/CD133- : Acquisition de marqueurs endothéliaux phénotypiques Formation de tubes in vitro –Cellules endothéliales matures : shedding vasculaire

16 Mobilisation des « PEC » Cellules stromales médullaires Hémangioblaste cKit + PEC circulants Précurseur hématopoïétique circulants mKitL MMP-9 sKitL Moelle osseuse Sang Barrière endothéliale Daprès Hristov, 2003

17 Mobilisation des PEC Micro-environnement, « niches » : –Fibroblastes, ostéoblastes, cellules endothéliales Protéinases : –Élastase, cathepsine G, métalloprotéinases matricielles (MMP) –Clivage de mkitL (kit ligand membranaire) par MMP-9 Facteurs de croissance –G-CSF, GM-CSF, EPO –SDF-1, VEGF, angiopoïétine

18 Processus de réparation endothéliale par les PEC intégration PEC CE CML Transdifférenciation Daprès Hristov, 2003 Matrice extracellulaire Cellule endothéliale Circulante (CEC) CD146 + CD31 + vWF+

19 Comparaison CEC versus PEC Cellule mature, provenant de la paroi vasculaire Témoin dune lésion vasculaire Expression de marqueurs endothéliaux : CD146, vWF, CD31… Pas dexpression des marqueurs CD45/CD133 Pas de potentiel clonogénique Progéniteur Témoin dune lésion vasculaire ? Dune régénération ? Faible expression de CD146, CD31 Faible expression de CD45, expression de CD133 Potentiel clonogénique CEC PEC 20 cellules/mL

20 Dimmeler, 2004

21 Différents phénotypes endothéliaux Cellule « tip » –Leader –Filopodes étendus –Signaux de direction –Migration à travers la matrice extracellulaire Cellule « stalk » –Prolifération –Vacuoles créant la lumière vasculaire –Produit la matrice Cellule « phalanx » –Devient quiescent –Monocouche –Jonctions serrées –Contact avec le péricyte

22 Induction et déstabilisation de la paroi capillaire Induction par hypoxie –HIF : complexe hétérodimérique sensible à lhypoxie –En hypoxie : dimérisation et activation des gènes cibles (HRE : promoteurs) Déstabilisation de la paroi capillaire : sortie de la quiescence endothéliale –NO libéré lors de lhypoxie : favorise la perméabilité induite par le VEGF –VEGF : VEGF-R2 : activité tyrosine kinase (MAPK/PI3K) –Angiopoiétines

23 Facteurs de croissance angiogéniques VEGF –Effet via les récepteurs VEGF-R1 (flt-1) et VEGF-R2 (flk/KDR) : activité tyrosine kinase –Favorise la migration et la prolifération endothéliale –Augmente la perméabilité vasculaire Angiopoïétine-1 –Effet via le récepteur Tie2 (tyrosine kinase) –Effet sur lengagement des précurseurs endothéliaux –Effet sur la migration endothéliale –Pas deffet sur la prolifération endothéliale –Recrutement des péricytes Angiopoïétine-2 –Expansion cellulaire b-FGF –Anti-apoptotique, activation dAkt

24 Inhibiteurs de langiogénèse Angiostatine –38 kDa, 3 kringles –Générée par protéolyse du plasminogène par métallo-élastases et MMP –Induit lapoptose des cellules endothéliales –Inhibe la prolifération endothéliale Endostatine –20kDa, fragment du collagène XVIII (cathépsine L, élastase) –Inhibition de la migration endothéliale (dépendant de eNOS) –Pro-apoptotique (réduction de Bcl-2, Bcl-XL) Thrombospondine-1 –Glycoprotéine haut poids moléculaire –Ligand de CD36 –Pro-apoptotique (p38-MAPK : activation des caspases)

25 Progéniteurs de la cellule endothéliale SourceProcédé disolement Marqueurs cellulaires Moelle osseuse Microbilles CD133 + CD146 -, CD133 +, CD31 -, vWF -,VE- cadhérine - Sang de cordon Microbilles CD34 + CD133 + Sang périphérique Microbilles CD34 + Adhésion PBMC CD133 + ou CD133 - CD146 : marqueur de la cellule endothéliale circulante

26 Identification des PEC dans un produit de thérapie cellulaire EA 3801

27 Identification des PEC dans un produit de thérapie cellulaire EA 3801


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