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In the second part of my talk, I would like to present to you the results I obtain during my PhD. The project I developed concern the …. Une Nouvelle Génération.

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1 In the second part of my talk, I would like to present to you the results I obtain during my PhD. The project I developed concern the …. Une Nouvelle Génération dAnalogues Non Naturels de lAntigène Tumoral Humain Melan-A/MART-1 : Conception, Propriétés Fonctionnelles Conception, Propriétés Fonctionnelles et Perspectives dUtilisation en Immunothérapie Antitumorale et Perspectives dUtilisation en Immunothérapie Antitumorale Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale Pr F. Amalric Groupe dImmunopharmacologie Structurale Dr J.-E. Gairin

2 Immunosurveillance du Cancer Réponse immunitaire contre le cancer - Immunité innée Lymphocytes NK, T Lymphocytes NK, T - Immunité acquise Lymphocytes T auxiliaires, cytolytiques Girardi et al, Science (2001) Identification des antigènes de tumeurs Rosenberg et al, Nature Medecine (1998) Immunothérapie du cancer Rosenberg N. Engl. J. Med. et al, (1985) - Antigènes peptidiques (IL- 2, cellules dendritiques) - Transfert adoptif de CTL antitumoraux Cellule Tumorale Lymphocyte T Van der Bruggen et al, Science (1991)

3 Identification des Antigènes de Tumeurs Caractérisation : - Approche génétique - Approche biochimique Origines : - Gènes silencieux - Différenciation - Mutations - Oncogènes et gènes suppresseurs de tumeurs - Virus associés aux tumeurs Caractéristiques : - Spécifiques des tumeurs - Partagés par différentes tumeurs

4 Garboczi, D. N., et al. Nature, 1996 V V Chaîne Lourde 2M C Présentation des Antigènes Tumoraux aux CTL Cellule T Cellule Cible CMH TCR Peptide Antigénique

5 Utilisation des Antigènes de Tumeurs en Immunothérapie Antitumorale - Cellules Dendritiques - ADN (Vecteur plasmidique) - Protéines ou Peptides Antigéniques - Vecteurs Bactériens ou Viraux Cellule T Cellule Présentatrice

6 Les Peptides Antigéniques comme Agents Thérapeutiques? AVANTAGES 1 - Réponse immunitaire spécifique 2 - Effets secondaires réduits 3 - Structure modulable LIMITATIONS 1 - Faible immunogénicité 2 - Dégradation rapide 3 - Mauvaise biodisponibilité

7 Melan-A/MART-1: Melan-A/MART-1: Un Candidat pour lImmunothérapie du Mélanome - Essais cliniques de phase III avec lantigène Melan-A sont en cours - Melan-A est exprimé dans 75% des mélanomes primaires ou métastatiques - Les peptides antigéniques Melan-A sont présentés par HLA-A* Des précurseurs de cellules T spécifiques de Melan-A existent à une fréquence élevée

8 Les Peptides Antigéniques Melan-A Présentés par HLA-A*0201: Les Peptides Antigéniques Melan-A Présentés par HLA-A*0201: Melan-A AAGIGILTV Melan-A EAAGIGILTV Melan-A A27L ELAGIGILTV E L L G I T V I G A Sliz et al, J. Immunol (2001) Valmori et al, J. Immunol (1998)

9 Les Antigènes Tumoraux sont Faiblement Immunogènes Les Antigènes Tumoraux sont Faiblement Immunogènes - Faible Antigénicité - Mauvaise présentation par le CMH - Dégradation dans les fluides biologiques - Faible Biodisponibilité

10 Faible Antigénicité des Antigènes Tumoraux Lexemple de Melan-A: ELAGIGILTV 0,012 AAGIGILTV EAAGIGILTV 4 0, Affinité pour HLA-A*0201 CI 50 nM Reconnaissance par les CTL CE 50 nM Dégradation t 1/2 min

11 Dégradation des Antigènes par les peptidases Dégradation des Antigènes par les peptidases Lexemple de MAGE-1.A1: Dégradation t 1/2 EADPTGHSY 30 min > 24 h ENMeADPTGHNMeSY 0, ,2 20 Affinité pour HLA-A1 CS 50 M Reconnaissance par les CTL CE 50 nM

12 Objectifs Des Travaux Peut-on concevoir des analogues de l antigène Melan-A combinant résistance à la dégradation par les peptidases et forte immunogénicité?

13 1 – Etude de la dégradation de lantigène Melan-A 2 – Conception danalogues structuraux de lantigène Melan-A 3 – Résistance à la dégradation par les peptidases I – Peut-on concevoir des Analogues Non Naturels de Melan-A résistant aux peptidases?

14 Diminution de lactivité antigénique des peptides dans le sérum humain Les peptides Melan-A perdent rapidement leur activité antigénique après incubation dans le sérum humain AAGIGILTVEAAGIGILTVELAGIGILTV Specific lysis (%) Concentration (nM) Lyse spécifique (%) Concentration (nM) T0 min T60 min T240 min Temps dincubation 1 - Etude de la dégradation de lantigène Melan-A: 1 - Etude de la dégradation de lantigène Melan-A:

15 Séparation et détection des peptides par analyse en HPLC-ESI/MS Dégradation de lantigène Melan-A dans le sérum humain 1 - Etude de la dégradation de lantigène Melan-A: 1 - Etude de la dégradation de lantigène Melan-A: Temps de rétention (min) Intensité Absorbance (215nm) 0.1 UV CIT CIR m/z m/z Intensité relative [M+H] Intensité 0 ELAGIGILTV Courant Ionique Reconstruit Courant Ionique Total Ayyoub et al, JBC (1999), RCMS (1998)

16 Détection et quantification des produits de dégradation non résolus en HPLC par analyse des spectres ESI/MS 1 - Etude de la dégradation de lantigène Melan-A: 1 - Etude de la dégradation de lantigène Melan-A: ELAGIGILTV LAGIGILTVQuantification Intensité Relative [M+H] + m/z RT : [M+H] [M+H] + RT : Intensité Relative RT : TIC Intensité [M+H] + 50 RT : Intensité Relative Intensité Temps (min) RIC Temps (min) LAGIGILTV m/z RT : RIC ELAGIGILTV m/z RT : Intensité RIC

17 1 - Etude de la dégradation de lantigène Melan-A: 1 - Etude de la dégradation de lantigène Melan-A: Cinétique Modèle de dégradation E LAGIGIL TV A GIGIL TV L AGIGIL AGIGIL GIGILTV E LAGIGIL L AGIGIL TV ELAGIGILTV Intensité CIR ( x10 5 ) LAGIGILTV AGIGILTV ELAGIGIL Principaux produits de dégradation amino-terminalecarboxy-terminale Temps (min) Temps (min) Quantité de peptide % Temps (min) Le peptide Melan-A est dégradé dans le sérum humain par des amino-peptidases et des dipeptidyl-carboxypeptidases

18 1 – Etude de la dégradation de lantigène Melan-A 2 – Conception danalogues structuraux de lantigène Melan-A 3 – Résistance à la dégradation par les peptidases I – Peut-on concevoir des Analogues Non Naturels de Melan-A résistant aux peptidases?

19 E - L A G I G I L - T V N-hydroxylation E, E, pE, dE, dL, NMeL, NMeE, MeL, Liaison peptidique Réduite, Rétro-inversée MeL, MeL,NMeT,dT,Amidation, Liaison peptidique Réduite E L A G I G I MeL T V E L A G I G I MeL T V H2NH2NH2NH2N C CH CH 2 C O … OH O CNHC O CH 3 … H3CH3CH3CH3C CH 2 CH CH 3 NH … Mécanisme de dégradation de Melan-A Modification minimale de la structure du peptide E L A G I G I L T V 2 - Conception dAnalogues Non Naturels de Melan-A: Stratégie 2 - Conception dAnalogues Non Naturels de Melan-A: Stratégie

20 2 - Conception dAnalogues Non Naturels de Melan-A: 2 - Conception dAnalogues Non Naturels de Melan-A: H2NH2N C O … CH R1 CH R2 NH C O C O OH Liaison Peptidique -- Méthylation du carbone Me-peptide H2NH2N C O … C R1 CH R2 NHC O CH 3 A, C H2NH2N C O … CH R1 CH R2 N C O CH 3 Méthylation de lazote engagé dans la liaison peptidique NMe-peptide A, C NH CH H HO … Hydroxylation de lamine terminale NOH-peptide A C O … NH 2 Amidation de la fonction carboxylique terminale Amide-peptide C NH CH 3 C O CH R1 … Acétylation de lamine terminale Acetyl-peptide A A : protection amino-terminale, C : protection carboxy-terminale DescriptionDésignationStuctureProtection

21 2 - Conception dAnalogues Non Naturels de Melan-A: 2 - Conception dAnalogues Non Naturels de Melan-A: NH C CH CH 2 C O … O Acide aminé cyclique Acide pyro-glutamique pE A H2NH2N … C R1 C O H Acides aminés de série D d-a.a. A, C A : protection amino-terminale, C : protection carboxy-terminale H2NH2N COOH CH CH 2 C O … acide glutamique E A Acides aminés H2NH2N CH 2 C O … A alanine A DescriptionDésignationStuctureProtection H2NH2N C O … CH R1 CH R2 NH C O C O OH -- Liaison peptidique

22 2 - Conception dAnalogues Non Naturels de Melan-A: 2 - Conception dAnalogues Non Naturels de Melan-A: A : protection amino-terminale, C : protection carboxy-terminale H2NH2N C O … CH R1 CH R2 NH C O C O OH Liaison peptidique (CH 2 -NH)]-a.a. 1-2 (CH 2 -NH)]-a.a. Liaison réduite H2NH2N C O … CH R1 CH R2 NH CH 2 C O OH A 1-2 (NH-CO)]-a.a. 1-2 (NH-CO)]-a.a. Liaison Rétro- Inversée H2NH2N C O … CH R1 CH R2 C NH O C O OH A, C DescriptionDésignationStuctureProtection

23 2 - Conception dAnalogues Non Naturels de Melan-A: 2 - Conception dAnalogues Non Naturels de Melan-A: Modifications Carboxy-terminales Modifications Amino-terminales Modifications Amino et Carboxy-terminales

24 1 – Etude de la dégradation de lantigène Melan-A 2 – Conception danalogues structuraux de lantigène Melan-A 3 – Résistance à la dégradation par les peptidases I – Peut-on concevoir des Analogues Non Naturels de Melan-A résistant aux peptidases?

25 1 – Les modifications simples protègent localement de la dégradation 2 – Des doubles substitutions sont nécessaires pour une protection totale [ D1]-Melan-A Modification Amino-terminale t 1/2 < 1 h LAGIGILTV DLAGIGIL DLAGIGILTV Peptide Restant (%) Temps (min) Résistance à la dégradation par les peptidases: [ 8-9 (CH 2 -NH)]-Melan-A Modification Carboxy-terminale t 1/2 ~ 3.5 h ELAGIGIL-[ (CH 2 -NH)]-TV ELAGIGIL-[ (CH 2 -NH)] LAGIGIL-[ (CH 2 -NH)]-TV Temps (min) Peptide Restant (%) [ D1, MeL8]-Melan-A Double Substitution t 1/2 > 24 h DLAGIGI-[ MeL]-TV DLAGIGIL LAGIGI-[ MeL]-TV h Temps (min/h) Peptide Restant (%)

26 Amidation de la fonction carboxylique terminale Autres modifications de la fonction carboxylique terminale I – Les Analogues Non Naturels de Melan-A sont résistants aux peptidases

27 1 – Affinité pour HLA-A* – Reconnaissance par les CTL spécifiques de Melan-A II – Les Analogues Non Naturels de Melan-A sont-ils antigéniques?

28 Les analogues de Melan-A résistant aux peptidases peuvent se lier efficacement à HLA-A*0201 Essai de liaison à HLA-A*0201 par compétition Lyse Spécifique (%) Concentration (nM) EAAGIGILTV AAGIGILTV ELAGIGILTV [ A1, MeL8] [NMeE1, Amide] [ A1, Amide] Lyse Spécifique (%) Concentration (nM) FAIBLE (9 / 18*) MOYENNE (6 / 18*) FORTE (3 / 18*) * : Nombre total danalogues doublement substitués 1 - Affinité pour HLA-A*0201:

29 II – Les Analogues Non Naturels de Melan-A sont-ils antigéniques? 1 – Affinité pour HLA-A* – Reconnaissance par les CTL spécifiques de Melan-A

30 Les analogues résistant à la dégradation peuvent être reconnus efficacement par les CTL spécifiques de Melan-A 2 - Reconnaissance par les CTL spécifiques de Melan-A: Essai de cytoxicité, lignée CTL polyclonale mono-spécifique de Melan-A Concentration (nM) EAAGIGILTV AAGIGILTV ELAGIGILTV Lyse Spécifique (%) [NMeE1, MeL8][ A1, MeL8][ A1, Amide] FAIBLE (9 / 18*) MOYENNE (5 / 18*) FORTE (4 / 18*) Concentration (nM) Lyse Spécifique (%) * : Nombre total danalogues doublement substitués

31 II – Les Analogues Non Naturels de Melan-A sont antigéniques Liaison à HLA-A*0201 Activité Compétitrice CI 50 [nM] < 0.01 > Reconnaissance par les CTL Activité Antigénique CE 50 [nM]

32 Conclusion - I What are the perspective to this work? One important question is to know if the increased in vitro immunogenicity of the non natural Melan-A analogues can be extrapolated to the induction of immune response. In vivo Studies in A2 Kb Tg mouse model are currently in development for the evaluation of several critical parameters for the efficient induction of a specific anti tumoral immune response. Indeed, we think that such compounds can be an attractive way to efficiently control the dose of peptide injected, and thus the avidity of the CTL induced. But we will have to check possible induction of peripheral tolerance due to peptide persistance in the body after jnjection. - Identification des liaisons peptidiques sensibles aux peptidases - Conception danalogues non naturels - Protégés efficacement de la dégradation par les peptidases - Bonne affinité pour HLA-A* Bonne reconnaissance par les CTL spécifiques de Melan-A Les Analogues Non Naturels de Melan-A sont résistants aux peptidases Les Analogues Non Naturels de Melan-A sont antigéniques

33 1 – Induction de CTL spécifiques de Melan-A 2 – Reconnaissance des peptides Melan-A 3 – Reconnaissance des cellules tumorales III - Les Analogues Non Naturels sont-ils Immunogènes ?

34 Phycoérytrine Streptavidine d après McMichael et O Callaghan Induction de CTL spécifiques de Melan-A: Mise en évidence de CTL spécifiques de Melan-A Marquage des CTL spécfiques de lantigène Analyse directe par cytométrie de flux Tri cellulaire Utilisation des tétramères de CMH-I Phycoérytrine Streptavidine Monomère 2M/peptide/HLA Phycoérytrine Streptavidine Monomère 2M/peptide/HLA Monomère 2M/peptide/HLA

35 1 - Stimulation de lymphocytes du sang périphérique de donneurs sains HLA-A* – Analyse par cytométrie de flux des cellules T spécifiques de Melan-A (CD8 + tétramères A2/Melan-A + ) Des CTL spécifiques de Melan-A sont induits après stimulation par les analogues non naturels Sans peptide0.1 Melan-A A27L [ A1, MeL8]-Melan-A [NOHG1, amide]-Melan-A Peptide utilisé pour la stimulation HD224HD410HD220 Immunogénicité in vitro (% A2/Melan-A tétramère + CD8 + ) [ E1, MeL8]-Melan-A [ D1, MeL8]-Melan-A [ A1,amide]-Melan-A [NOHG1, MeL8]-Melan-A [ p E1, MeL8]-Melan-A ELAGIGILTVSans peptide [ E1, MeL8]-Melan-A 3.1%5.3%0.1% 2.8%0.1%4.5% CD8 FITC 0.3%0.1% 0.7% HD224 HD410 HD220 A2/Melan-A Tétramère PE 1 - Induction de CTL spécifiques de Melan-A:

36 1 – Induction de CTL spécifiques de Melan-A 2 – Reconnaissance des peptides Melan-A 3 – Reconnaissance des cellules tumorales III - Les Analogues Non Naturels sont-ils Immunogènes ?

37 2 - Reconnaissance des peptides Melan-A 100 Lyse Spécifique (%) concentration (nM) 100 Lyse Spécifique (%) concentration (nM) EAAGIGILTV AAGIGILTV ELAGIGILTV 1 - Tri des cellules CD8 + A2/Melan-A/tétramère + CD8 FITC HD224 CD8 FITC [ A1, MeL8] ELAGIGILTV A2/Melan-ATétramère PE Peptide utilisé pour la stimulation 2 - Reconnaissance des peptides Melan-A: Les CTL induits avec les analogues non naturels reconnaissent efficacement les peptides Melan-A

38 1 – Induction de CTL spécifiques de Melan-A 2 – Reconnaissance des peptides Melan-A 3 – Reconnaissance des cellules tumorales III - Les Analogues Non Naturels de Melan-A sont-ils Immunogènes ?

39 Les CTL induits par la stimulation avec les Analogues Non Naturels de Melan-A Reconnaissent Spécifiquement et Lysent efficacement les Cellules Tumorales 3 - Reconnaissance des cellules tumorales: Mel 290 Mel 275 Na8 [ A1, MeL8] [ E1, MeL8] [ D1, MeL8] ELAGIGILTV Peptide utilisé pour la stimulation Lyse Spécifique (%) Lyse Spécifique (%) Lyse Spécifique (%) Lyse Spécifique (%) Rapport Effecteur/Cible Rapport Effecteur/Cible

40 Conclusion - II What are the perspective to this work? One important question is to know if the increased in vitro immunogenicity of the non natural Melan-A analogues can be extrapolated to the induction of immune response. In vivo Studies in A2 Kb Tg mouse model are currently in development for the evaluation of several critical parameters for the efficient induction of a specific anti tumoral immune response. Indeed, we think that such compounds can be an attractive way to efficiently control the dose of peptide injected, and thus the avidity of the CTL induced. But we will have to check possible induction of peripheral tolerance due to peptide persistance in the body after jnjection. Les CTL induits in vitro par les analogues non naturels de Melan-A: - Reconnaissent efficacement les peptides Melan-A Les analogues non naturels de Melan-A Induisent efficacement des CTL in vitro - Limmunogénicité in vitro est améliorée - Reconnaissent efficacement les cellules tumorales Les Analogues Non Naturels de Melan-A sont Immunogènes

41 Conclusions Générales What are the perspective to this work? One important question is to know if the increased in vitro immunogenicity of the non natural Melan-A analogues can be extrapolated to the induction of immune response. In vivo Studies in A2 Kb Tg mouse model are currently in development for the evaluation of several critical parameters for the efficient induction of a specific anti tumoral immune response. Indeed, we think that such compounds can be an attractive way to efficiently control the dose of peptide injected, and thus the avidity of the CTL induced. But we will have to check possible induction of peripheral tolerance due to peptide persistance in the body after jnjection. Les Analogues Non Naturels de Melan-A: - Résistent à la dégradation par les peptidases - Présentent une Immunogénicité améliorée Nouvelle génération danalogues antigéniques combinant résistance aux peptidases et immunogénicité améliorée - Stimulent la prolifération de CTL spécifiques des tumeurs

42 - Etudes chez la souris transgénique HLA-A2/K b - Réponse Immunitaire ou Tolérance? Perspectives Limmunogénicité in vivo? Généralisation de lapproche? - Etude dautres antigènes tumoraux (MAGE-1, MAGE-10, NY-ESO-1, Tyrosinase…) - Les analogues non naturels de Melan-A : Règle ou Exception? - Utilisation en immunothérapie du Mélanome?

43 Remerciements… Immunopharmacologie Structurale Onco-immunologie Clinique LUDWIG INSTITUTE FOR CANCER RESEARCH Danila Valmori Pedro Romero Jean-Edouard Gairin Isabelle Dufau Christophe Nguyen Sophie Millot, Delphine Labourdette Spectrométrie de Masse et Structure de Biomolécules Bernard Monsarrat Stéphane Claverol Joelle Riond, Elisabeth Neuhauser, Bo Xu, Sylviane Julien, Honoré Mazarguil Odile Schiltz Paul Alvinerie Maha Ayyoub


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