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A type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria Rachel D. Hood, P. Singh, F. Hsu, T. Günever, M. A. Carl, R. R. S. Trinidad,

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1 A type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria Rachel D. Hood, P. Singh, F. Hsu, T. Günever, M. A. Carl, R. R. S. Trinidad, J. M. Silverman, B. B. Ohlson, K. G. Hicks, R. L. Plemel, M. Li, S. Schwarz, W. Y. Wang, A. J. Merz, D. R. Goodlett and Joseph D. Mougous Publié en janvier 2010 Hadj-Saïd Jessica

2 Pseudomonas aeruginosa G - Pathogène opportuniste à large spectre d’hôtes patients brulés patients immunodéprimés mucoviscidose Infections aiguës Infections chroniquesSystème de sécrétion de type VI (Potvin et al. 2009)

3 Hcp Secretion Island-I (II ou III) encoded type VI secretion system HSI-I : pathogénicité de P.aeruginosa (Potvin et al. 2009;Morgous et al. 2006)

4 Système de sécrétion de type VI PpkA- Ƥ Fha1- Ƥ H1-SST6 activé phosphoryle PppA P P (Filloux et al. 2008) HCP: Hémolysin Coregulated Protein hexamère nanotubes (Ballister, Mougous 2008) VgrG: Valine glycine rich G gp5 gp27 (queue du bactériophage) trimère perforation des membranes bactériennes (Leiman et al. 2009) déphosphoryle Fha1H1-SST6 inactivé

5 Objectifs Trouver de nouvelles protéines sécrétées par le H1-T6SS Comparer le sécrétome H1-T6SS fonctionnel (état ouvert) H1-T6SS non fonctionnel (état fermé) Et de les étudier (pathogénicité, cible)

6 ∆pppA a le H1-T6SS actif (état ON) ∆clpV1 a le H1-T6SS inactif (état OFF) Comment caractériser l’état ouvert et l’état fermé de H1-T6SS? Western Blot révélant Hcp1-V Fusion traductionnelle: P P

7 Comparaison des sécrétomes des mutants de P.aeruginosa ∆pppA H1-T6SS ON VgrG1 VgrG4 Tse1 Tse2 Tse3 ∆clpV1 H1-T6SS OFF Spectrométrie de masseSécrétomes

8 ON OFF Deux protéines VgrG sont sécrétées par H1-T6SS VgrG sont bien exportées par H1-T6SS Pour une raison inconnue on a plusieurs formes de VgrG4 Western Blot révélant VgrG1-V et VgrG4-V Fusion traductionnelle: ON OFF

9 Tse1-3: pas de sécrétion sans Hcp (composants) Western Blot révélant Tse1-V, Tse2-V, Tse3-V Fusion traductionnelle: ON OFF ON OFF Trois protéines Tse1, Tse2, et Tse 3 sont sécrétées par H1-T6SS Tse1-3 sont bien exportées par H1-T6SS

10 Sécrétion de Hcp en absence de Tse1-3 ON OFF Western Blot révélant Hcp1-V Pas de sécrétion de Hcp en absence de VgrG Tse1-3 sont des substrats Tse1-3 et VgrG: substrats ou composants du H1-T6SS ? VgrG1 et VgrG4 sont des composants du H1-T6SS

11 Identification des protéines Tse1, Tse2, et Tse 3 ClpV1 n’est plus produite en absence de la kinase PpkA ∆tse1-3 n’empêche pas la présence de ClpV1 Microscopie à fluorescence (fusion clpV1-GFP) PpkAFha1 phosphoryle déphosphoryle PppA SST6 activé Tse1-3 sont des substrats

12 RetS Synthèse de RsmZ (ARN non codant) La voie Gac/Rsm est-elle impliquée dans la sécrétion des Tse? Western Blot révélant Tse1-V, Tse2-V, Tse3-V P H N term C term D Senseur: GacS P (GDR Pseudomonas , Patrick Plesiat ) Régulateur de réponse: GacC SST3 L’activation de la voie Gac/Rsm augmente la production et la sécrétion des Tse1-3 Tse1-3 toujours sécrétées par le H1-T6SS Biofilm ON OFF

13 Caractérisation des protéines Tse2 et Tsi2 ∆tsi2 (+) Vecteur avec tse2 (-) Vecteur contrôle Inductible à l’IPTG protéine toxique tse2 Inhibition de la croissance P.aeruginosa tsi2 protéine d’immunité Type VI Secretion Immunity protein 2 Tse2 Tsi2 Tse2 seul Tse2 Tsi2

14 Interaction des protéines Tse2 et Tsi2 Lyse (sonication) Bactérie (culot) Fraction solubles (SN) Cytoplasme + périplasme Fraction membranaire (culot) ultra tsi2 tse2-GSK tsi2-V tse2-GSK Western Blot révélant Tse2-GSK et Tsi2-V tsi2 tse2-GSK tsi2-V tse2-GSK

15 Interaction directe entre Tsi2 et Tse2 Caractérisation des protéines Tse2 et Tsi2 Interaction des protéines Tse2 et Tsi2 Coimmunoprécipitaion de Tsi2-V et Tse2-GSK tsi2 tse2-GSK tsi2-V tse2-GSK Tsi2 Tsi2-V Tse2-GSK Bille d’agarose couplé à l’Ac anti-VSV-G Autres protéines tsi2 tse2-GSK tsi2-V tse2-GSK Western Blot révélant Tse2-GSK et Tsi2-V

16 Tse2 agit-elle sur les cellules eucaryotes? L’expression de tse2 diminue dramatiquement le nombre de colonies Coexpression de tsi2 et de tse2 restaure la viabilité à un niveau similaire au contrôle Cellules eucaryotes : Saccharomyces cerevisiae DO=1↔ cellules.mL -1 Tse2 intracellulaire a un effet délétère sur les cellules eucaryotes (S. cereviae, HeLa.) DO=1 DO=0.5DO=0.25DO=0.13DO=0.06 DO=0.03

17 Cytométrie de fluxMicroscopie à fluorescence L’expression de tse2 diminue la fluorescence Cellules humaines HeLa GFP tse Cytométrie de flux L’expression de tse2 augmente le % de cellules rondes Tse2 agit-elle sur les cellules eucaryotes? Tse2 a un effet délétère sur les cellules eucaryotes.

18 Escherichia coli Tse2 agit-elle sur les cellules procaryotes? Burkholderia thailendensis L’expression de tse2 seul inhibe la croissance bactérienne La protéine Tsi2 protège la bactérie de Tse2

19 P.aeruginosa peut-elle utiliser la toxine Tse2 contre les cellules eucaryotes via le H1-T6SS? Mesure de la cytotoxicité de différentes souches P.aeruginosa sur des HeLa ∆retS : Tse2 hypersécrétée Pas de cytotoxicité provenant de la protéine Tse2 via le H1-T6SS Haute cytotoxicité Basse cytotoxicité ∆retS ∆ClpV1 : Tse2 non sécrétée PAO1 : Tse2 non sécrétée Tse2 n’est pas injectée par le H1-T6SS Tse2 extracellulaire non cytotoxique

20 Expérience de croissance compétitive entre ≠ souches de P.aeruginosa Nécessité d’un contact cellulaire donneur-receveur Tse2 requiert un H1-T6SS fonctionnel Tse2 impacte la croissance de la souche receveuse (dénuée de Tsi2) P.aeruginosa peut-elle utiliser la toxine Tse2 contre les cellules procaryotes via le H1-T6SS? ∆retS Milieu solideMilieu liquide ∆retS : Tse2 hypersécrétée ∆retS ∆clpV1 ∆retS ∆clpV1 +clpV1 ∆retS ∆tse2

21 Conclusions VgrG1, VgrG4 sont des composants H1-T6SS L’activation de la voie Gac/Rsm, qui active la formation de biofilm, augmente la quantité des Tse. Tsi2, la protéine d’immunité, permet à l’organisme de se protéger de Tse2 Tse2 intracellulaire inhibe la croissance de cellules eucaryotes et procaryotes H1-T6SS est incapable d’injecter Tse2 dans les cellules eucaryotes H1-T6SS est incapable d’injecter Tse2 dans les souches de Pseudomonas aeruginosa sans établir un contact Biofilm Tse1, Tse2 et Tse3 sont des substrats du H1-T6SS

22 Conclusions et Discussions P.aeruginosa Tse2 H1-T6SS : mode de communication entre P.aeruginosa Mort: C’était une autre bactérie Vie: C’est une P. aeruginosa H1-T6SS : capacité d’adaptation (fitness) en présence d’autres bactéries. (Russell & Mougous, juillet 2011) Expression et activation du SST6 sont élevées dans les isolats de patients atteint de mucoviscidose (Yahr, 2006)

23 Tse3 Tse2 Tse1 Membrane interne Membrane externe Membrane interne Membrane externe Tsi2 Tsi3 Tsi1 Tse3 Tse1 Tse2 Pepdidoglycane Cellule bactérienne receveuse Cellule bactérienne donneuse Tsi2-Tse2 VgrG Cytoplasme Hcp Modèle hypothétique

24 Pourquoi H1-T6SS ne peut pas injecter ses toxines dans des cellules eucaryotes Sur quoi Tse2 agit dans les cellules eucaryotes et les cellules procaryotes Perspectives

25 Merci de votre attention

26 Abondance des protéines selon l’état ouvert ou fermé Protéines communes aux deux états Hcp sécrété par autre système

27 Comparaison des sécrétomes des mutants de P.aeruginosa Spectromètre de masse Digestion trypsique Sécrétome 326 Non Communes État on (∆pppA) État off (∆clpV1) État on/off R1R2 CommunesTotal

28 ∆pppA ∆clpV1 Comparaison des sécrétomes des mutants de P.aeruginosa ONOFF 371 protéines VgrG4 VgrG1 Tse1 Tse2 Tse3 ∆pppA ∆clpV1 300 prot 262 prot 19 prot 14 prot 18 prot

29 P.aeruginosa peut viser les cellules bactériennes mais pas eucaryotes avec Tse2 Compet sur long terme Ils mettent 10x plus de cellules donneuses que de cellules receveuses pour augmenter la probabilité de contact Milieu liquide Les souches donneuses Tse montre encore une fois un avantage de croissance sur les cellules receveuses qui n’ont pas Tsi2


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