ouverture vers de nouvelles stratégies thérapeutiques.

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1 ouverture vers de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Fonction de la forme  du récepteur des œstrogènes dans les cellules de cancer du sein humain : ouverture vers de nouvelles stratégies thérapeutiques. Angélique Gougelet Le 26 janvier 2007 Laboratoire de pharmacologie cellulaire et moléculaire des anticancéreux UMR CNRS 8612 Sous la direction du Dr. J.-M. Renoir

2 Cancer du sein 1er cancer féminin dans les pays occidentaux.
Chaque année en France : (Ligue Nationale contre la Cancer 2000) nouveaux cas décès Facteurs de risque : D’après McPherson et coll. 2000, BMJ, 321:

3 Traitements Chirurgie : technique du ganglion sentinelle.
Radiothérapie : adjuvante ou néo-adjuvante. Chimiothérapie : adjuvante ou néo-adjuvante : protocole CMF : cyclophosphamide (agent alkylant) + méthotrexate et 5-FU (antimétabolites) ; protocole FEC : 5-FU + épirubicine (inhibiteur des topoisomérases II) + cyclophosphamide ; protocole ET : épirubicine + docétaxel (inhibiteur de la dépolymérisation des microtubules).

4 Œstrogènes et hormonothérapie
50-60 % de cancers œstrogéno-dépendants ; hormones stéroïdes impliquées dans le développement et la différenciation de l’appareil reproducteur et de la glande mammaire ; liaison à un récepteur nucléaire (ER) : anti-œstrogènes : Nolvadex (SERM) Faslodex (SERD) ; œstrone (E1), œstradiol (E2), œstriol (E3) synthétisés à partir des androgènes par action de l’aromatase ovarienne principalement : anti-aromatases : Fémara, Arimidex ; Blocage des voies mitogéniques : anti-HER2 : Herceptin. OH (CH2)9SO(CH2)3CF2CF3 N O

5 Récepteur aux œstrogènes
Récepteur nucléaire (NR3A) Facteur de transcription 2 isoformes : ER clonée en 1985 (Walter et coll. PNAS, 82 : ). ER clonée en 1996 (Kuiper et coll. PNAS, 93 : ; Mosselman et coll. FEBS lett, 392 :49-53). 5 domaines fonctionnels : D’après Ogawa et coll. 1998, BBRC, 243: 122-6 DBD LBD dimérisation NLS A/B C D E F ER 66 kDa 1 180 263 302 595 553 P-box AF-1 AF-2 149 214 248 530 500 ER 55 kDa N-term C-term N-term C-term

6 53 % d’homologie au niveau du LBD ;
96 % d’homologie au niveau du DBD ; 96 DBD AF-1 Facteurs de transcription : Fonction de transactivation constitutive AF-1 N-term C-term ER 66 kDa A/B C D E F 1 180 263 302 595 553 Fonction de transactivation ligand-dépendante AF-2 AF-2 N-term C-term Domaine AF-1 tronqué dans ER. ER 55 kDa 1 149 214 248 530 500

7 Distribution tissulaire
Cerveau : neuroprotection, humeur ER et ER Système cardiovasculaire : cardioprotection, vasodilatation ER tronqué et ER Sein : différenciation finale normal : 20 % ER+ER+ cancer : 70 % ER++ER+ Foie : facteurs de coagulation, récepteurs aux lipoprotéines ER Poumons : ER Tractus gastro-intestinal : ER Tractus urinaire : ER Os : maintien de la densité osseuse ER et ER Tractus génital : ovaire : ER (thèque), ER (granulosa) utérus : ER > ER testicule : ER, ER prostate : ER

8 Mécanismes d’action de ER
membrane plasmique ER hsp90 hsp70 p23 IP ligand ER hsp90 p23 hsp70 MAP kinases P IP ER ligand AKT P P PKA Enveloppe nucléaire machinerie transcriptionnelle POL TF corégulateurs transcription nucléosome GGTCAnnnTGACC ERE TATA

9 Rôle protecteur de ER expression de ER diminuée dans les tissus invasifs ; tumeurs ER+ mieux différenciées, moins agressives ; propriétés antiprolifératives : inhibition des cyclines (A, D1, E) ; induction des inhibiteurs des kinases cycline-dépendantes p21waf1/cip1 et p27kip1 ; propriétés inhibitrices de la transactivation ER-dépendante. Compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de la forme  du récepteur des œstrogènes. Mise au point et développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

10 Lignées cellulaires de cancer du sein
MDA-ER- MCF-7 HERB HE-5 MDA-ER- MCF-7 HERB HE-5 ER ER RT-PCR Western blot ER ER MCF-7 : modèle de référence ER++ ; HE-5 : MDA-MB-231 transfectée de manière stable avec la forme  de ER (Touitou et coll. JSBMB, 1991, 40 :231-7) ; HERB : MDA-MB-231 transfectée de manière stable avec la forme  de ER (Mueller et coll. JBC, 2003, 278 : ).

11 Plan Introduction Transactivation œstrogéno-dépendante ER répresseur de la transcription ER-dépendante Rôles des fonctions de transactivation AF-1 et AF-2 de ER Approches thérapeutiques à visée anti-œstrogénique : Avantages du RU Les ligands de la hsp90 Les inhibiteurs d’histone-déacétylases Conclusions et perspectives

12 Modèle de transactivation de ER
HAT HAT SWI/SNF TRAP220 CBP/p300 Ac SRC1 Ac Ac Ac TF TAF POL agoniste ER TATA ERE nucléosome Ac transcription Ac D’après Moggs et Orphanides. 2001, EMBO Rep, 2 :

13 Modèle de transrépression de ER
HDAC HDAC NCoR sin3 HDAC2 TATA ERE nucléosome Ac SMRT Antagoniste mixte ER D’après Moggs et Orphanides. 2001, EMBO Rep, 2 :

14 Modèle de transrépression de ER
TATA ERE nucléosome sin3 NCoR SMRT HDAC HDAC2 TF TAF POL D’après Moggs et Orphanides. 2001, EMBO Rep, 2 :

15 Activation œstrogéno-induite
16 h MCF-7 HE-5 HERB Imax Cmax Vit (GGTCAcagTGACC) x 3 E2 8 10-10 6 10-8 5 10-9 gen 9 10-6 tk (GGTCAcagTGACC) x 2 16 2,5 4 3 10-7 2 C3 GGTGGcagTGACC 1,3 Ø 10-11 1,4 La séquence de l’ERE module les niveaux d’induction maximale (Imax). L’ Imax d’un promoteur est atteinte pour différentes concentrations (Cmax) d’un même ligand. Les concentrations nécessaires à l’activation maximale d’un promoteur varient avec le ligand. Les concentrations de ligand nécessaires pour une activation maximale varie avec l’isoforme de ER. La transactivation ER-dépendante est influencée par le contexte cellulaire. + importante dans les cellules MCF-7 ; promoteurs  répondeurs : MCF-7 : tk > Vit > C3  0 MDA : Vit > tk  C3

16 Plan Introduction Transactivation œstrogéno-dépendante ER répresseur de la transcription ER-dépendante Rôles des fonctions de transactivation AF-1 et AF-2 de ER Approches thérapeutiques à visée anti-œstrogénique : Avantages du RU Les ligands de la hsp90 Les inhibiteurs d’histone-déacétylases Conclusions et perspectives

17 Activité suppressive de ER
gen + ER E2 + ER + ER gen E2 PR MCF-7 Vit tk ER  la capacité transactivatrice de ER : au niveau de promoteurs endogènes ou exogènes quels que soient le type d’ERE et la lignée cellulaire considérés.  non transfecté  0,1 µg ER 10 nM E2 ou 1 µM gen

18 Activité suppressive de ER et acétylation
Trichostatine A (TSA) = inhibiteur des histone-déacétylases. Vit tk MCF-7 HE-5  ER +10 nM E2 (id.1 µM gen) ER +10 nM E2+TSA 1µM ER possède des propriétés de dominant négatif régulées par des processus de déacétylation ou par recrutement d’histone-déacétylases.

19 Introduction Transactivation œstrogéno-dépendante ER répresseur de la transcription ER-dépendante Rôles des fonctions de transactivation AF-1 et AF-2 de ER Approches thérapeutiques à visée anti-œstrogénique : Avantages du RU Les ligands de la hsp90 Les inhibiteurs d’histone-déacétylases Conclusions et perspectives

20 AF-1/AF-2 de ER et transactivation œstrogéno-induite
Cellules MCF-7 et HE-5. 2 gènes rapporteurs Vit et tk. Transfection transitoire de 0,1 µg de ER mutants : N C 477 *** 1 96 161 195 447 ER-AF-1 N C 1 65 99 381 351 ER-AF-2 Exposition des cellules à 10 nM E2 ou 1 µM gen  1 µM (TSA) Importance de l’acétylation.

21 Au niveau de Vit dans les cellules MCF-7
ER ER+TSA ER-AF-2 ER-AF-2+TSA 1/2 ER ER+TSA ER-AF-1 ER-AF-1+TSA ER CoR déAc AF-2 AF-1 ER AF-2 AF-1 HDAC ERE ER synergie AF-2 Ac ER-AF-2 +TSA AF-2 CoA Ac + - ER ER-AF-2

22 Au niveau de tk dans les cellules MCF-7
ER ER+TSA ER-AF-2 ER-AF-2+TSA ER ER+TSA ER-AF-1 ER-AF-1+TSA X 2 synergie HDAC AF-2 AF-1 ER déAc HDAC ER AF-2 AF-1 ER ERE AF-2 CoA Ac ER-AF-2 +TSA + - ER Les propriétés suppressives de ER sont différemment régulées selon le promoteur. 23

23 Au niveau de Vit dans les cellules HE-5
ER ER +TSA ER-AF-2 ER-AF-2+TSA 4 8 12 C E2 1E-8 Induction DéAc ER AF-2 AF-1 HDAC ER AF-2 AF-1 ERE ER Les propriétés suppressives de ER sont différemment régulées selon la lignée cellulaire. 24

24 Sur le gène endogène PR dans les MCF-7
ER  ARNm de PR de 50 %. + - TSA 1 µM ER AF-1  + faiblement ARNm PR. région AF-1 de ER impliquée dans son activité suppressive sur PR. synergie de la région AF-2. actine MCF-7 MCF-7 + 0,1 µg ER PR L’inhibition des HDAC : bloque l’activité suppressive de ER. MCF-7 + 0,1 µg ER-AF-2 potentialise l’activation induite par ER AF-1. ER possède des propriétés de dominant négatif liées à sa région AF-1, régulées par : acétylation / déacétylation de son domaine AF-1 ou des cofacteurs recrutés ; recrutement d’histone-déacétylases ; Thérapie ciblée sur le maintien de son activité. 25

25 Plan Introduction Transactivation œstrogéno-dépendante ER répresseur de la transcription ER-dépendante Rôles des fonctions de transactivation AF-1 et AF-2 de ER Approches thérapeutiques à visée anti-œstrogénique : Avantages du RU Les ligands de la hsp90 Les inhibiteurs d’histone-déacétylases Conclusions et perspectives

26 L’ anti-œstrogène de référence : le tamoxifène
50 % des tumeurs œstrogéno-dépendantes diagnostiquées répondent à cet agent. Activité agoniste à l’origine de cancers secondaires de l’endomètre. 40 % des patientes traitées rechutent par acquisition de résistances associées à : Une diminution des concentrations intratumorales en Tam ; Une altération de l’expression de ER ; Une altération du niveau d’expression des corégulateurs de ER ; Une hyperactivation des voies de signalisation œstrogéno-dépendantes. recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques : Anti-œstrogènes purs ; Inhibiteurs de la hsp90 ; Inhibiteurs des histone-déacétylases.

27 Plan Introduction Transactivation œstrogéno-dépendante ER répresseur de la transcription ER-dépendante Rôles des fonctions de transactivation AF-1 et AF-2de ER Approches thérapeutiques à visée anti-œstrogénique : Avantages du RU Les ligands de la hsp90 Les inhibiteurs d’histone-déacétylases Conclusions et perspectives

28 Anti-œstrogènes Anti-œstrogènes mixtes :
Molécule à activité agoniste ou antagoniste selon les tissus. Le tamoxifène référence pour le traitement du cancer du sein. Anti-œstrogènes purs : OH O N S Raloxifène Tamoxifène N SO2 OH (CH2)9SO(CH2)3CF2CF3 CF2CF3 O OH H H H H O ICI 182,780 RU 58668 Pas de transactivation possible par gêne stérique. Dégradation protéasome-dépendante de ER. Indiqués pour le traitement de seconde intention des cancers du sein résistants au Tam.

29 AE et stabilité de ER L’OHT stabilise les 2 formes de ER.
RU Le RU induit une dégradation protéasomale : durable de ER ; transitoire de ER. ER ER L’OHT stabilise les 2 formes de ER. E2 1 µM - + OHT 1 µM RU 1 µM MG132 5 µM MCF-7 HE-5 HERB ER ER OHT ER

30 AE et transactivation œstrogéno-induite
MCF-7 HE-5 HERB  Vit  tk Pouvoir inhibiteur équivalent des 2 AE dans les MDA-MB-231 : HERB : 70 % sur Vit 60 % sur tk HE-5 : % sur Vit 45 % sur tk Effet plus marqué du RU sur les cellules MCF-7 et MELN : RU : 40 % sur Vit 75 % sur tk  100 % dans les MELN OHT :  sur Vit 55 % sur tk 85 % dans les MELN RU > OHT sur l’activité et la stabilité de ER.

31 RU et cycle cellulaire MCF-7 MCF-7 + ER NT Arrêt du cycle en G0/G1 dans les cellules MCF-7 ER+ et ER+/ER+. Faible activité pro-apoptotique dans les cellules MCF-7. RU La présence de ER dans les cellules MCF-7 : induit la mort cellulaire ; 72h Sub-G1 G0/G1 C 2,8 61,2 RU 1 µM 4,2 69,5 ER 1 µg 12 53,6 RU + ER 21,6 65,5  l’activité pro-apoptotique du RU.

32 OHT et cycle cellulaire
NT OHT MCF-7+ER MCF-7 Arrêt du cycle en G0/G1 < au RU. Faible activité pro-apoptotique dans les cellules MCF-7. Peu d’effet sur les cellules ER+/ER+ contrairement au RU. Activité bénéfique du RU sur les cellules MCF-7 ER+/ER+ par rapport à l’OHT. 72h Sub-G1 G0/G1 C 4,7 79,7 OHT 1µM 7,9 83,4 ER 1µg 16,8 68,3 OHT + ER 18,9 72,8

33 Plan Introduction Transactivation œstrogéno-dépendante ER répresseur de la transcription ER-dépendante Rôles des fonctions de transactivation AF-1 et AF-2 de ER Approches thérapeutiques à visée anti-œstrogénique : Avantages du RU Les ligands de la hsp90 Les inhibiteurs d’histone-déacétylases Conclusions et perspectives

34 La hsp90 : chaperon moléculaire de nombreuses protéines oncogènes
Récepteurs stéroïdiens Récepteur des œstrogènes Récepteur de la progestérone Autres p53 Kinases Cdk4 Cdk6 Cdc2 AKT c-Raf-1 ErbB2 Cochaperons FKBP51/52 Cyp40 hsp70 p23 hsp40 CHIP hsp90 Cycle cellulaire Apoptose Prolifération Croissance/Développement Cancer Angiogenèse D’après Maloney et Workman. 2002, Expert Opin Biol Ther, 2 : 3-24

35 hsp90 et maturation de ER hsp70 foldosome hsp90 Hop hsp40 p23 ATP ADP
poche de liaison au ligand fermée p23 hsp90 ER Hop p23 hsp40 ATP ADP poche de liaison au ligand ouverte Hop hsp70 immunophiline hétérocomplexe mature hsp90 ER p23 hsp70 IP D’après Pratt et Toft. 2003, Exp Biol Med, 228 :

36 Inhibiteurs de la hsp90 Bloquent les sites de liaison à l’ATP :
en N-terminal : geldanamycine (GA) et radicicol (Rd) ; en C-terminal : novobiocine (Nv). 1 236 272 629 732 N M C MEEVD ATP/clientes radicicol geldanamycine novobiocine Ubiquitinylation des protéines clientes immatures par l’E3 ubiquitine-ligase CHIP (C-terminus of hsp70-interacting protein). Dégradation par le protéasome.

37 Activité antiproliférative des inhibiteurs de la hsp90
% prolifération à 72h GA 1 µg/mL Rd Nv 0,2 mM MCF-7 40 38 30 MERA 24 HERB 45 25 55 MDA-ER- 42 20 58 Effets comparables des 3 inhibiteurs sur les 2 lignées cellulaires ER+ : Nv  Rd  GA Effets comparables des 3 inhibiteurs sur les MDA ER+ et ER- : Rd  GA  Nv avantage en cas d’échappement thérapeutique de cellules ER+ ou ER-. Pouvoir antiprolifératif influencé par le variant de ER exprimé dans les cellules. 37

38 Inhibiteurs de la hsp90 et régulateurs du cycle cellulaire
MCF-7 72 h E2 100 nM ICI 182, nM GA 1 µg/mL - + + - + GA > Rd > Nv  . GA :  cyclines D1 et E ;  cdk2, 4 et 6 ;  cdc2 ;  c-Raf-1 ;  phospho-p70S6K ;  phospho-ERK. p70S6K phospho-p70S6K c-Raf-1 phospho-p42/p44 cycline D1 cycline E cdk2 cdk4 cdk6 cdc2

39 Inhibiteurs de la hsp90 et cycle cellulaire
Rd GA S G1 Cycline B Cdc2 p21 p53 G2 M Rd GA Ras Raf MEK p110 p85 PI3K AKT mTOR ErbB2 P70S6K ERK Rd GA Cdk4/6 Cycline D1 Cdk2 Cycline E pRb E2F HDAC E2F pRb

40 * Activité pro-apoptotique des inhibiteurs de la hsp90
Sub-G1 72 h GA 1 µg/mL Rd Nv 0,2 mM MCF-7 X 3  MERA X 13 HERB X 10 X 2 MDA- ER- X 12 X 6 MCF-7 HERB * Peu d’effet sur les cellules MCF-7 :  absence de caspase 3 Activité pro-apoptotique identique sur les 3 types de MDA. MERA MDA-ER- GA agent le plus puissant.

41 * Activité et stabilité de ER
Inhibition de l’activité transcriptionnelle œstrogéno-induite des 2 ER : MELN C E2+GA E2 GA Rd Nv E2+Rd E2+Nv HERB * Dégradation protéasome-dépendante des 2 formes de ER : MG132 5 µM C GA + - Rd Nv ER ER 16 h ER protéine cliente de la hsp90 Inhibiteurs de la hsp90 = traitement de choix pour les cancers œstrogéno-dépendants 42

42 Plan Introduction Transactivation œstrogéno-dépendante ER répresseur de la transcription ER-dépendante Rôles des fonctions de transactivation AF-1 et AF-2 de ER Approches thérapeutiques à visée anti-œstrogénique : Avantages du RU Les ligands de la hsp90 Les inhibiteurs d’histone-déacétylases Conclusions et perspectives

43 Les histone-déacétylases (HDAC)
18 membres en 4 classes : + Sirtuines 1 à 7 : Classe III. D’après De Ruijter et coll. 2003, Biochem J, 370 : HDAC1 HDAC2 HDAC3 HDAC8 HDAC11 HDAC6 HDAC10 HDAC4 HDAC5 HDAC7 HDAC9 Classe I Classe IIb Classe IIa Classe IV Inhibiteurs d’HDAC = stratégie anticancéreuse prometteuse : Classes I et II impliquées dans la prolifération des cellules cancéreuses ; HDAC1 et HDAC6 surexprimées dans les cellules de cancer du sein.

44 Acides gras à chaîne courte
Inhibiteurs des HDAC inhibiteurs cibles essais cliniques combinaisons testées Acides hydroxamiques trichostatine A (TSA) classes I et II 5-aza-2’-déoxycytidine chimiothérapie SAHA III lymphome cutané T myélome multiple maladie de Hodgkin 17-AAG trastuzumab LAQ824 I Chimiothérapie LBH589 Acides gras à chaîne courte acide valproïque classes I et IIa II cancers colorectaux acide butyrique leucémie 5-aza-2’-déoxycytidine 17-AAG Peptides cycliques depsipeptide classe I lymphome cutané apicidine HDAC 1 et 3 STI-571 Benzamides MS-275 HDAC 1, 2 et 3 lymphome irradiation chimiothérapie

45 TSA et cycle cellulaire
NT TSA MCF-7+ER MCF-7 MCF-7 HE-5 HERB MDA-C > à faible concentration sur les cellules ER+. * Forte activité pro-apoptotique dans les cellules MCF-7 et MCF-7 ER+. Activité antiproliférative de la TSA : = à forte concentration sur les cellules ER+ et ER- ; * Accumulation des cellules en G2/M. 72 h Sub-G1 G2/M C 2,8 19,7 TSA 0,1 µM 40,7 29,8 ER 1 µg 12 17,8 TSA + ER 57,6 22,9 45

46 Inhibition des HDAC et transactivation de ER
MCF-7 HE-5 HERB TSA 1 µM 16 h - + Vit E2 10 nM 7,4 16,8 6 10,4 5,2 16,2 gen 1 µM 9,3 17,9 14,5 3,7 28,4 tk 15,9 96 2,6 8,2 3,8 16,6 15,8 113 2,1 9,1 1,7 10,7 X2 X6 X3 X3 X4 X8 X6 Activation de la transcription œstrogéno-induite de ER : > au niveau de tk dans les cellules MCF-7 et HE-5 ; > dans les cellules MCF-7 par rapport aux HE-5. Activation plus forte de la transcription ER-dépendante dans les cellules HERB, en présence de génistéine. Activité de la TSA modulée par la lignée cellulaire, l’isoforme de ER et le promoteur ciblé. 46

47 - + - + Inhibition des HDAC et stabilité de ER - + + + ER  MCF-7
- + + + MG132 5 µM MCF-7 MDA-C HE-5 HERB TSA 1 µM - + ARNi HDAC1 HDAC1 - + ER   MCF-7 ER HE-5 ER HERB 16 h TSA  ER et ER dans les MDA-MB-231 mais  ER dans les MCF-7. Dégradation protéasome-dépendante de ER dans les cellules MCF-7. Résultats similaires après suppression de l’expression d’HDAC1 par un ARNi spécifique L’HDAC1 paraît être un régulateur clé des effets induits par la TSA. Le niveau d’expression d’HDAC1 varie avec la lignée cellulaire. À l’origine des niveaux d’expression différents de ER en présence de TSA et après suppression de l’HDAC1? 47

48 - - - + - + Association RU/TSA et stabilité de ER + + +- ++ ER ER
+ + - + RU 1 µM - - - + TSA 1 µM MCF-7 ER ER HE-5 HERB 16 h ++ +- L’association RU/TSA :  la stabilisation de ER induite par le RU dans les cellules HERB ;  peu ER dans les cellules HE-5 par rapport au RU seul ; potentialise la dégradation de ER induite par le RU dans les cellules MCF-7. Association RU/TSA prometteuse.

49 Association TSA/RU et transactivation de ER
E2+OHT E2+OHT+TSA  Vit  tk MCF-7 HE-5 HERB C E2+TSA E2+RU E2+RU+TSA C E2+TSA E2+RU E2+RU+TSA C E2+TSA E2+RU E2+RU+TSA Le RU conserve ses propriétés inhibitrices de la transactivation ER et ER-dépendante en présence de TSA (70 % ). Le RU inhibe la transcription œstrogéno-induite sans intervention des HDAC. La TSA augmente l’activité agoniste de l’OHT dans les cellules MCF-7 et MELN. L’inhibition induite par l’OHT requiert l’intervention de HDAC contrairement au RU. Association RU/TSA avantageuse par rapport à la combinaison OHT/TSA. 49

50 Effets combinés de la TSA et du RU sur les cellules MCF-7
La TSA conserve ses propriétés antiprolifératives en présence de RU. MCF-7 RU 72 h Sub-G1 G2/M C 2,8 19,7 TSA 0,1 µM 40,7 29,8 RU 1 µM 4,2 19,6 TSA + RU 47,6 24,1 Addition des propriétés pro-apoptotiques de la TSA et du RU sur les cellules MCF-7. La TSA induit toujours une accumulation des MCF-7 en G2/M en présence de RU. TSA RU+TSA

51 Effets combinés de la TSA et du RU sur les cellules MCF-7 ER+
RU+TSA TSA +ER MCF-7 + ER MCF-7 57,6 47,6 21,6 64,5 RU+ER RU+TSA+ER Pouvoir antiprolifératif de l’association RU/TSA le plus puissant. RU + TSA induit une apoptose + forte que le RU ou la TSA isolément. RU + TSA plus efficace sur les cellules MCF-7 ER+/ER+ que sur les cellules MCF-7 au niveau de la croissance cellulaire et de l’apoptose.

52 Expression des régulateurs du cycle cellulaire
RU 1 µM - + TSA 0,1 µM ER 1 µg - + cycline D1 ER cycline E p27kip1 phospho-Rb p21waf1/cip1 L’association RU + TSA + ER :  la cycline D1 et ER ;  p21waf1/cip1 et p27kip1 ;  l’induction de la cycline E observée en présence de TSA ;  la forme phosphorylée Rb.

53 Association RU/TSA et arrêt du cycle cellulaire
G1 ER TSA + RU+ ER E2 Cdk2 Cycline E p130 Cdk4/6 Cycline D1 p21 p21 ou p27 E2F pRb pRb E2F HDAC

54 Plan Introduction Transactivation œstrogéno-dépendante ER répresseur de la transcription ER-dépendante Rôles des fonctions de transactivation AF-1 et AF-2 de ER Approches thérapeutiques à visée anti-œstrogénique : Avantages du RU Les ligands de la hsp90 Les inhibiteurs d’histone-déacétylases Conclusions et perspectives

55 Conclusions (1) ER dominant négatif de ER et potentiel suppresseur de tumeur. Approche thérapeutique de choix = maintenir / induire son activité. Le RU (comme l’ICI 182,780) : démontre des propriétés pro-apoptotique et antiproliférative sur des cellules ER+/ER+ surtout ; affecte essentiellement l’expression de ER. anti-œstrogènes purs > anti-œstrogènes mixtes. Inhibiteurs de la hsp90 et inhibiteurs des HDAC : Alternatives de choix pour le traitement du cancer du sein notamment des tumeurs résistantes aux thérapies classiques.

56 Deux stratégies thérapeutiques optimales pouvant être envisagées:
Conclusions (2) Deux stratégies thérapeutiques optimales pouvant être envisagées: Approche non spécifique : un inhibiteur de la hsp90 + un inhibiteur d’HDAC Ex. : 17-AAG / SAHA ; 17-AAG / LBH589 Approche ciblant ER : un anti-œstrogène pur visant préférentiellement ER + un ligand activant spécifiquement ER Affranchissement des risques d’acquisition de résistance à un agent anticancéreux. Association de ces molécules

57 Perspectives (1) Décryptage complet des mécanismes de régulation de ER : Acétylation directe de ER ou de ses cofacteurs en présence de TSA? Identification des sites précis d’acétylation de ER (région AF-1). Identification des régions de ER impliquées dans son activité suppressive et sa régulation. Identification des corégulateurs/HDAC recrutés par les dimères ER/ER et ER/ER. Identification de nouveaux agents thérapeutiques plus spécifiques : Immunoprécipitation. Mutagenèse dirigée et transfection transitoire des mutants. Immunoprécipitation de la chromatine. Inhibiteur ou ARNi contre une HDAC diminuant l’activité de ER.

58 Perspectives (2) Ciblage spécifique au niveau de la tumeur :
« drug delivery » = incorporation d’agents cytotoxiques dans des formes galéniques préservant les tissus sains. Approche particulièrement indiquée pour : les inhibiteurs à spectre d’action large les inhibiteurs de protéines ubiquitaires les molécules administrées à forte dose les molécules insolubles les molécules instables comme les ARNi ciblage amélioré par greffage d’anticorps : Ex. : immunoliposomes de LAQ824 avec des anticorps anti-HER2 à leur surface. Inhibiteurs d’HDAC de la hsp90 du protéasome

59 Remerciements EQUIPE VIII : Michel Renoir Céline Véronique
FINANCEMENT : Ligue Nationale Contre le Cancer ANALYSES EN FACS : Michel Kornprobst OUTILS : J.-C. Faye K.S. Korach et S.O. Mueller F. Vignon D.P. McDonnell