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Contrôle de la mort cellulaire par la voie des MAPK1/3 Sébastien Cagnol Equipe du Dr Ellen Van Obberghen-Schilling Institut de Signalisation, Biologie.

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2 Contrôle de la mort cellulaire par la voie des MAPK1/3 Sébastien Cagnol Equipe du Dr Ellen Van Obberghen-Schilling Institut de Signalisation, Biologie du Développement et Cancer CNRS UMR6543 Sous la direction du Dr Jean-Claude Chambard

3 La mort cellulaire programmée ou Apoptose Conservée au cours de lévolution Mécanisme présent au sein de chaque cellule Permet lauto-élimination physiologique des cellules

4 La mort cellulaire programmée ou Apoptose Au cours du développement embryonnaire Dans lorganisme adulte Maintien de lhoméostasie cellulaire et tissulaire Remodelage des tissus Renouvellement de certains tissus

5 Excès de mort cellulaire Destruction tissulaire brutale (ischémie, hépatite) Défauts de mort cellulaire Maladies Autoimmunes Maladies neurodégénératives Lapoptose pathologique Cancer

6 Les caspases clivage auto-protéolytique procaspases caspases initiatrices dimérisation caspases effectrices

7 Les caspases caspases effectrices Modifications du cytosquelette Fragmentation de l ADN et du noyau Inhibition du potentiel mitochondrial Réorganisation de la membrane plasmique condensation cellulaire corps apoptotiques

8 caspase 8 caspases effectrices 3,6,7 Apaf1 caspase 9 Apoptosome récepteurs de mort procaspase 9 cytochrome c mitochondrie FADD Lactivation des caspases Stress cellulaire Agents antimitotiques Agents génotoxiques procaspase 8 Bid

9 Apaf1 cytochrome c mitochondrie La voie mitochondriale Stress cellulaire Agents antimitotiques Agents génotoxiques Apoptosome procaspase 9

10 Apaf1 cytochrome c mitochondrie Stress cellulaire Agents antimitotiques Agents génotoxiques La voie mitochondriale Apoptosome procaspase 9

11 caspases effectrices 3,6,7 Apaf1 caspase 9 cytochrome c mitochondrie Stress cellulaire Agents antimitotiques Agents génotoxiques La voie mitochondriale Apoptosome procaspase 9

12 caspases effectrices 3,6,7 Apaf1 caspase 9 récepteurs de mort cytochrome c mitochondrie FADD Stress cellulaire Agents antimitotiques Agents génotoxiques procaspase 8 DISC Les récepteurs de mort Apoptosome procaspase 9

13 caspases effectrices 3,6,7 Apaf1 caspase 9 cytochrome c mitochondrie FADD Stress cellulaire Agents antimitotiques Agents génotoxiques procaspase 8 Les récepteurs de mort récepteurs de mort Apoptosome procaspase 9

14 caspase 8 caspases effectrices 3,6,7 Apaf1 caspase 9 récepteurs de mort cytochrome c mitochondrie FADD Stress cellulaire Agents antimitotiques Agents génotoxiques procaspase 8 Bid Les récepteurs de mort Apoptosome procaspase 9

15 survie apoptose Facteurs de survie matrice extracellulaire sérum cellules en prolifération

16 Survie cellulaire PI3K PKCMAPK MEK Raf PKA Jaks AKT AMPc Facteurs de survie Les voies de survie Croissance cellulaire Prolifération cellulaire Différenciation cellulaire NF B

17 GTP La voie des MAPK1/3 Prolifération Différenciation Survie cellulaire Migration cellulaire Ras MEK1/2 P P Raf-1 MAPK1/3 P P P KSR GTP Substrats cytosoliques Substrats nucléaires P Récepteurs tyrosine kinase Ras Récepteurs couplés aux protéines G Intégrines B-Raf

18 MEK1/2 Raf1 MAPK1/3 P P P P Le contrôle de lactivité des MAPK Forme active phosphorylée Forme inactive déphosphorylée MAPK Phosphatases (MKP 1,2,3)

19 MEK1/2 Raf1 MAPK1/3 P P Lenlèvement du sérum inhibe les MAPK Forme active phosphorylée MAPK Phosphatases (MKP 1,2,3) Forme inactive déphosphorylée pMAPK1/3 MAPK1 sérum :+- tamoxifène :

20 MEK1/2 Raf1 MAPK1/3 tam tamoxifène P P P P Lactivation de Raf-1:ER maintient les MAPK actives pMAPK1/3 MAPK1 sérum :+-- + tamoxifène : Raf-1:ER Raf1 tam ER MAPK Phosphatases (MKP 1,2,3)

21 contraste de phaseiodure de propidium + sérum Les fibroblastes CCL39 Raf-1:ER survie sérum apoptose

22 survie sérum contraste de phaseiodure de propidium apoptose contraste de phaseiodure de propidium MAPK Raf1 tam ER Les fibroblastes CCL39 Raf-1:ER Lactivation de Raf:ER protège les cellules CCL39 contre la mort induite par enlèvement de sérum et dancrage (Le Gall. MBC 00 11,1103)

23 La voie des MAPK inhibe lapoptose mitochondriale mitochondrie caspase 9 PAR PARP P Bclx L tamoxifen (1 M) : sérum 24h PARP CCL39 Raf-1:ER caspase CCL 39 Bclx L enlèvement de sérum ( h ) PARP p-MAPK MAPK1

24 tamoxifène : caspase 9 p-MAPK MAPK1 procaspase 9 p37 p enlèvement de sérum (h) : La voie des MAPK inhibe lactivité et lactivation de caspase 9 contrôle- sérum (14h) - sérum + tam activité caspase 9

25 caspases effectrices 3,6,7 Apaf1 caspase 9 cytochrome c mitochondrie Lapoptose mitochondriale MAPK1/3 MEK1/2 Raf1 tam ER Apoptosome procaspase 9

26 contrôle- sérum (14h)- sérum + tam dapi caspase-3 activée cytochrome c La voie des MAPK ne bloque pas la sortie du cytochrome c * * * * * * * * *

27 Apaf1 Apoptosome fractions protéiques lysat cellulaire mAU kDa Fractions : Etude de la multimérisation d Apaf-1 par chromatographie d exclusion colonne

28 cytochrome c Apaf-1 cytochrome c Apaf-1 M r (kDa) Fractions : cytochrome c Apaf-1 contrôle - sérum + tamoxifène - sérum La voie MAPK ne bloque pas l oligomérisation d Apaf1

29 Fractions : contrôle - sérum M r (kDA) La voie des MAPK ne bloque pas le recrutement de caspase 9 dans l apotosome caspase 9 - sérum + tamoxifène

30 contrôle Fractions : M r (kDA) Fractions de haut poids moléculaire concentrées sérum La voie des MAPK ne bloque pas le recrutement de caspase 9 dans l apotosome caspase 9 - sérum + tamoxifène contrôle - sérum + tamoxifène

31 caspases effectrices 3,6,7 Apaf1 caspase 9 cytochrome c mitochondrie Lapoptose mitochondriale MAPK1/3 MEK1/2 Raf1 tam ER Apoptosome procaspase 9

32 MEK1/2 MAPK1/3 Raf1 tam P P P P ER ? La protection par Raf1:ER est-elle dépendante des kinases MEK/MAPK ? caspase 9

33 U0126 MEK1/2 MAPK1/3 Raf1 tam P P P P caspase 9 ER ? La protection est-elle dépendante des kinases MEK/MAPK ?

34 MAPK1/3 MEK1/2 U0126 Linhibition du clivage de caspase 9 dépend de lactivité MEK sérum (24h) + tam-S+S p-MAPK MAPK1 U0126 (µM) : caspase 9 Raf1 tam ER apoptose sérum MAPK sérum : U0126 : %1% caspase 9 p-MAPK

35 h + S- S - sérum + tamoxifène (24hr) addition retardée de U0126 : Lactivité MEK est nécessaire de façon continue caspase 9 MAPK1/3 MEK1/2 U0126 Raf1 tam ER

36 MEK1/2 MAPK1/3 Raf1 tam P P P P protéine antiapoptotique ER ? La protection est-elle dépendante de linduction dune protéine antiapoptotique ? caspase 9

37 MEK1/2 MAPK1/3 Raf1 tam P P P P protéine antiapoptotique ER ? La protection est-elle dépendante de linduction dune protéine antiapoptotique ? caspase 9 émétine

38 + S - S - sérum + tamoxifène (24hr) MAPK haddition retardée démétine : p-MAPK Leffet protecteur de la voie MAPK dépend de la synthèse protéique caspase 9 Linhibition de caspase 9 dépend de mécanismes traductionnels et post-traductionnels

39 tamoxifène : caspase 9 T125A p-MAPK Le mécanisme de protection ne dépend pas de la phosphorylation de caspase 9 sur son résidu T125 PETP CN P 125 Allan et al, Nat Cell Biol ,647 caspase 9 - sérum NT MAPK1/3 P P

40 Conclusions Lactivation de la voie des MAPK inhibe le clivage de caspase 9 Leffet protecteur dépend de mécanismes traductionnels et post-traductionnels Lactivation de la voie des MAPK nempêche pas la formation de lapoptosome

41 caspases effectrices 3,6,7 caspase 9 mitochondrie MEK1/2 MAPK1/3 P P P P IAPs Quel est le mécanisme dinhibition ? Raf1 tam ER caspase 9 XIAP tamoxifen : sérum 24h Apoptosome procaspase 9

42 Rôle antiapoptotique de la voie MAPK dans les tumeurs Développement tumoral Inactivation de lapoptosome Mutation de B-Raf MAPK1/3 ?

43 Le MAPK paradoxe

44 Lactivation des MAPK induit la mort cellulaire

45 stimulation au sérum tamoxifène expo stimulation (min) : p-MAPK MAPK1 Stimulation de la voie des MAPK dans les cellules HEK293 Raf1-ER

46 iodure de propidium Lactivation prolongée des MAPK induit la mort des cellules HEK293 tamoxifène 24hcontrôletamoxifène 48h

47 Lactivation prolongée des MAPK induit l apoptose des cellules HEK tamoxifène ( h ) : MAPK1 p-MAPK PARP - + ZVAD tam (48h) : PARP ADN sub-G1 (%) tamoxifène ( h ) :

48 tamoxifène 48h (1 M) : CHX 1 g/mL U M PARP p-MAPK MAPK1 Lapoptose dépend de lactivité MEK et de la synthèse protéique Cycloheximide (CHX) = inhibiteur de la synthèse protéique

49 tamoxifène (48h): h10 clivage de PARP (%) 0 Une protéine apoptotique est accumulée durant les premières heures addition retardée de cycloheximide

50 tamoxifène (48h): h addition retardée de U0126 après Lapoptose dépend dune activation continue de la voie MAPK clivage de PARP (%)

51 caspase 8 caspases effectrices 3,6,7 Apaf1 caspase 9 récepteurs de mort cytochrome c mitochondrie Bclx L Crm A Apoptosome procaspase 9

52 CD8 Crm ABclx L clivage de PARP (%) -++tamoxifène (48h) : 0 + CD8 La mort induite par la voie MAPK dépend de la voie caspase 8

53 Clivage de PARP (%) - + tamoxifène (28h) : CH11TRAIL TNF 20 CH11 TNF TRAIL La voie MAPK favorise lapoptose induite par les récepteurs de mort Fas et DR4/5 FasDR4/5TNFR ligand (14h) :

54 La voie MAPK augmente lexpression de FADD par un mécanisme post-transcriptionnel tamoxifène ( h ) : FADD contrôle tamoxifène ( 24h ) amplification par RT-PCR quantité initiale dARN (ng) FADD 36B4 MAPK1 CH11 TRAIL FasDR4/5 caspase 8 FADD

55 La mort induite par la voie MAPK ne dépend pas des récepteurs de mort FADD MAPK siRNA GFP siRNA FADD DN-FADD PARP DN-FADD CH11 TRAIL FADD FasDR4/5 DN-FADD siRNA FADD caspase 8 tamoxifène (48h) :

56 - ++ +IETD-fmk :-- PARP caspase 3 active caspase tamoxifène (48h) :+ Crm A: + - La voie MAPK induit lactivation de caspase 8 procaspase tamoxifène ( h ) : p42 fragments clivés p28 MAPK1 tamoxifène (48h) :

57 Conclusions partie 2 Lactivation prolongée des MAPK1/3 induit l apoptose des cellules HEK293 La voie des MAPK active la caspase 8 indépendamment des récepteurs de mort La voie des MAPK augmente lexpression de FADD et favorise l apoptose induite par les récepteurs de mort Lapoptotose dépend de mécanismes traductionnels et post-traductionnels

58 Perspectives partie 2 Activation de caspase 8 indépendante des récepteurs de mort Augmentation dexpression de FADD est elle impliquée dans la régulation physiologique des récepteurs de mort ? Ce mécanisme pourrait-il servir à réactiver lapoptose dans les tumeur à forte activité MAPK ? Implication dans les maladies neurodégénératives ? Mécanismes d activation de caspase 8 ? Mécanismes dinduction post-transcriptionnelle de FADD ? Rôle dans des modèle physiologiques d apoptose induite par les récepteurs Fas et DR4/DR5 ? Lien avec une activité nucléaire prolongée des MAPK ?

59 caspase 8 caspases effectrices caspase 9 mitochondrie MAPK1/3 Comment réconcilier les deux modèles ? Bid Apoptosome procaspase 9

60 Remerciements Equipe Ellen Van Obberghen : Etienne Boulter Jean-Claude Chambard Ivana Fantozzi Dominique Grall Anna Mansour Sylvie Maubant Samantha Sauze-Fernandez INSERM U526 Dir P Auberger INSERM U452 Dir P Boquet Laboratoire d Oncophamacologie Dir: G Milano Dr Urszula Hibner Dr Alain Eychène Equipe Anne-Odile Hueber Equipe Gilles Pagès Equipe Jacques Pouysségur UMR 6543 Association pour la Recherche sur le Cancer La Ligue Régionale Contre le Cancer Laboratoire du Dr Véronique Paquis

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63 +S - sérum insTam- Bim EL Bim S BIM +S-S-S+Tam LLNL : émetine : + ++ Bim EL P-MapK BclXl

64 caspase Tamoxifène : U0126 : p-MAPK p-MEK - sérum - Le mutant Raf T481A bloque le clivage de caspase 9

65 tamoxifène (48h) : - + PARP p-MAPK MAPK3 cellules attachées cellules en suspension tamoxifène (24h)

66 Clivage de PARP (%) tamoxifène: CH11: DN-Fas : Lapoptose induite par la voie des MAPK ne dépend pas du récepteur Fas

67 * * Morphologie des cellules HEK 293 mourantes


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