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Mécanismes de résistance aux antibiotiques/ Interprétation de lantibiogramme J.L. Mainardi Unité Mobile de Microbiologie Clinique Hôpital Européen Georges.

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1 Mécanismes de résistance aux antibiotiques/ Interprétation de lantibiogramme J.L. Mainardi Unité Mobile de Microbiologie Clinique Hôpital Européen Georges Pompidou Université Paris V René Descartes Paris

2 Aminosides-Macrolides Tétracyclines-acide fusidique Linézolide- chloramphénicol Béta-lactamines Glycopeptides Fosfomycine Quinolones Généralités (1) Mécanisme de résistance lié au mode daction de lantibiotique 4 Colimycine 2 Rifampicine, sulfamides

3 Généralités (2) Enzymatique : le plus fréquent Enzymatique : le plus fréquent Modification de la cible Modification de la cible Imperméabilité Imperméabilité Efflux Efflux La résistance est soit naturelle soit acquise 4 grands mécanismes de résistance

4 Bactéries à Gram+ : colistine (structure) acide nalidixique (cible) Bactéries à Gram+ : colistine (structure) acide nalidixique (cible) Bactéries à Gram- : vancomycine (structure) Bactéries à Gram- : vancomycine (structure) Anaérobie : aminosides (imperméabilité) Anaérobie : aminosides (imperméabilité) Genre Klebsiella : amoxicilline, ticarcilline, Pipéracilline (pénicillinase) Genre Klebsiella : amoxicilline, ticarcilline, Pipéracilline (pénicillinase) Espèce E. faecalis : Céphalosporines (tous les entérocoques)- lincomycine-Clindamycine Espèce E. faecalis : Céphalosporines (tous les entérocoques)- lincomycine-Clindamycine La résistance naturelle est caractéristique dune espèce ou dun genre ou dun groupe Généralités (3)

5 Antibiotiques actifs sur la paroi bactérienne 1) Béta-lactamines 2) Glycopeptides 3) Fosfomycine

6 Gram +Gram - Acides teicoiques Acides lipoteicoiques

7 Structure du peptidoglycane

8 Glycosyltransférase PL P Transpeptidase Synthèse du peptidoglycane

9 Protéines de liaison à la pénicilline Classe A Classe B Plp transpeptidase glycosyltransférase non catalytique

10 PL P Béta-lactamine Inactivation de la PLP Arrêt de la synthèse du peptidoglycane Action des béta-lactamines

11 BETA- LACTAMASE Peptido Membrane interne Cytoplasme Résistance aux béta-lactamines

12 PLP Nor male BETA LACTAMASE Peptidoglycane Membrane interne Cytoplasme PLP mutée MODIFICATION DE CIBLE Résistance aux béta-lactamines PLP mutée

13 PLP Nor male Membrane externe (Gram-) IMPERMEABILITE BETA LACTAMASE Peptido Membrane interne Cytoplasme PLP mutée MODIFICATION DE CIBLE Porine modifiée Béta-lactamine Résistance aux béta-lactamines

14 PLP Nor male Membrane externe (gram-) IMPERMEABILITE BETA LACTAMASE Peptido Membrane interne Cytoplasme EFFLUX PLP mutée MODIFICATION DE CIBLE Porine modifiée Béta-lactamine Résistance aux béta-lactamines

15 PL P Glycopeptide Arrêt de la synthèse du peptidoglycane Arrêt de la transpeptidation Action des glycopeptides D-Ala 5 -D-Ala 4

16 O Cl O O H N NHN H O C l OH O O NH NHCH 3 O H N O NH HO OH OH HO H 2 N HO 2 C O O O O O CH 2 OH HO HO H 3 C OH NH 2 CH 3 N H N O O H 3 C CH 3 O O H X D -Ala 4 - D -Ala 5 Vancomycine

17 PL P Glycopeptide Modification de la cible Résistance aux glycopeptides D-lactate or D-serine en 5 ème position Van A, Van B, Van C

18 Précurseur du peptidoglycane 2 Précurseur du peptidoglycane 1 Cytoplasme Peptidoglycane En z Fosfomycine Action de la fosfomycine

19 Précurseur 2 Précurseur 1 Cytoplasme Peptidoglycane Enz Fosfomycine Résistance à la fosfomycine Mutation

20 Antibiotiques actifs sur la synthèse des protéines 1) Aminosides 2) Macrolides-lincosamides 3) Cyclines 4) Chloramphénicol 5) Ac. Fusidique 6) Linézolide

21 ARN23S + ARN5S + protéines ARN16S + protéines Fonctionnement du ribosome

22 MacrolidesLincosamidesSynergistines 23S 16S Cyclines Chloramphénicol Linézolide Aminosides Sites de fixation des antibiotiques

23 Résistance aux ATB actifs sur la synthèse protéique Modification de la cible par mutation Méthylation du ribosome pour les macrolides Modification de la cible par mutation Méthylation du ribosome pour les macrolides Production dune enzyme Production dune enzyme Enzymes détruisant les aminosides Enzymes détruisant les aminosides Efflux Efflux Macrolides Macrolides Tétracyclines Tétracyclines

24 Antibiotiques actifs sur la synthèse des acides nucléiques 1) Quinolones 2) Rifampicine 3) Sulfamides - triméthroprime

25 Sous- unité A des Gyrases et topoisomérases Sous- unité B des Gyrases et topoisomérases Quinolone ADN Action des quinolones

26 Résistance aux quinolones Le plus fréquent : modification de la cible (gyrase et topoisomérase) Le plus fréquent : modification de la cible (gyrase et topoisomérase) Efflux Efflux Protection de la cible: protéines Qnr Protection de la cible: protéines Qnr Inactivation enzymatique: Aminoside acétyltransférase Inactivation enzymatique: Aminoside acétyltransférase

27 Précurseur 2 Précurseur 1 Précurseur 3 Purines DH PS DH PS Précurseur 4 DH FR DH FR ARNADN transcription ARN polymérase Action sulfamides, triméthoprime et rifampicine

28 Précurseur 2 Précurseur 1 Précurseur 3 Purines DH PS DH PS Précurseur 4 DH FR DH FR ARNADN transcription ARN polymérase Rifampicine Sulfamides Trimethop. Action sulfamides, triméthoprime et rifampicine

29 Précurseur 2 Précurseur 1 Précurseur 3 Purines DHPS DHPS Précurseur 4 DHFR DHFR ARNADN transcription ARN polymérase Rifampicine Sulfamides Triméthop. Résistance aux sulf., triméth. et rifampicine Mutation

30 Support de la résistance Gènes portés par des chromosomes Gènes portés par des plasmides Gènes portés par des transposons Conséquences –Transmission de bactéries à bactéries (plasmide et transposon) –Émergence de la résistance –Résistance multiple +++ par différents mécanismes pour une classe dantibiotique et par différents mécanismes pour des classes différentes: bactéries multirésistantes

31 A 50-year old man developed a nosocomial pneumonia. An empiric treatment with piperacillin is begun. The microbiological results of the protected brush specimen showed: 10 4 UFC/ml of Staphylococcus aureus Penicillin: R Piperacillin: S Oxacillin (methicillin): S All the other antibiotics: S What do you think about this antibiogramme ?: * True * False

32 ANSWER * FALSE - Impossible antibiogramme - Strain penicillin resistant = piperacillin resistant due to the production of penicillinase. - The activity is restored in presence of -lactamase inhibitor as clavulanic acid or tazobactam

33 A 40 year-old man, with a mechanical mitral prosthesis, presented a catheter-related infection with positive blood cultures due to Staphylococcus aureus: PenicillinR Oxacillin (methicillin) R ImipenemS Kanamycin R Tetracycline R Vancomycin R All the other antibiotics are resistant What do you think about this antibiogramme ?: * True * False

34 ANSWER * FALSE - Impossible antibiogramme because: - Oxacillin R due to the acquisition of additional PBP2a with a low affinity for methicillin - Oxacillin R = imipenem R - Oxacillin R = resistant to all -lactams - Is the strain really resistant to vancomycin ? (GISA ? High level resistance to vancomycin)

35

36 1996: Japan (Hiramatsu et al, JAC 1997) –MIC: 8 µg/ml vanco, 16 µg/ml teicoplanin –Heterogeneous resistance : ( Lancet, 1997 ) 1.3 to 20% in Japanese hospitals Since 1997: USA, United-kingdom, France, Spain, and many other countries In Europe: true incidence not known but seems lower (0.5 to 1.5 %) in absence of outbreak (Schmitz et al.,1999; Chesneau et al., 2000; Marchese et al ; 2000; Reverdy et al., 2001) Clinical isolates with decreased susceptibility to vancomycin

37 Clinical isolates with decreased susceptibility to teicoplanin MICs: 8-16 µg/ml for teicoplanin/ 2-4 for vancomycin 1988:Brunet et al ( Eur J Clin Microbiol, 1990 ) 1989: Kaatz et al ( J Infect Dis, 1990 ), Vedel et al ( Eur J Clin Microbiol, 1990 ) : Mainardi et al ( J Infect Dis, 1995 )

38 Le risque majeur chez S. aureus Infection with vancomycin-resistant Staphylococcus aureus containing the vanA resistance gene –CMI de la vancomycin: 1024 µ g/ml –Présence du gène vanA –Présence de E. faecalis avec gène VanA –Sensibilité aux : Chloramphénicol, Linézolide, Minocycline, Synercid R, triméthoprime- sulfaméthoxazole –Chang et al, N Engl J Med 2003;348:

39 What do you think about this antibiogramme of Staphylococcus aureus ? Oxacillin (methicillin)R KanamycinR GentamicinS TobramycinR AmikacinS NetilmicinS * True ? * False ?

40 ANSWER * FALSE - Impossible phenotype because: - Kanamycin resistant = Amikacin resistant

41 What do you think about this antibiogramme of Staphylococcus aureus ? Oxacillin R Kanamycin R Gentamicin R Tobramycin R Amikacin R Netilmicin S * True ? * False ?

42 ANSWER * FALSE - Impossible phenotype because: - Gentamicin resistant = resistant to all aminoglycosides, except streptomycin

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44 A methicillin-resistant strain of Staphylococcus aureus is interpreted as: PefloxacinR CiprofloxacinS Norfloxacin S Is it true ? or false ?

45 ANSWER * FALSE - Impossible phenotype because: - Cross-resistance for all fluoroquinolones in S. aureus - Alterations of the same target (DNA gyrase)

46 What is the percentage of S. aureus resistant to fluoroquinolones in hospital ? - 10 % - 30 % - 60 % - 90 %

47 ANSWER - Hospital :depending the percentage of methicillin resistance - 20 à 30% in France

48 What is the percentage of S. aureus resistant to fluoroquinolones in the community ? - < 10 % - 30 % - 60 % - 90 %

49 ANSWER - Community: < 10%

50 SARM-communautaire

51 What do you think about this antibiogramme of Enterococcus faecalis ? AmoxicillinS Cephalotin (1ère génération)S GentamicinS ErythromycinS ClindamycinR VancomycinS Is it true or false ?

52 ANSWER: - FALSE - Impossible phenotype because : - Enterococci are naturally resistant to cephalosporins - Enterococci are naturally resistant to aminoglycosides (low level: MIC µ g/ml) - True concerning the clindamycin

53 Among these different bacteria species, which of these are naturally resistant to vancomycin ? Enterococcus faecium Enterococcus gallinarium Enterococcus casseliflavus Enterococcus faecalis Escherichia coli

54 ANSWER Enterococcus gallinarium Enterococcus caselliflavius Escherichia coli

55 - Normal C-terminal amino acid of the pentapeptide chain of the peptidoglycan: D-alanineVanco S - Modification of this amino acid: resistance to vancomycin VanA, VanB : D-lactate (MIC 16 µ g/ml) VanC : D-serine (MIC = 8 µg/ml) -VanC : detection on the antibiogramme: : not easy ! - MICs of vancomycin > MICs of teicoplanin - Necessity to identify the species (E.gallinarium)

56 D- Ala Vanco R Vanco S Vanco D-Ser ou D-lactateVanco Chaîne pentapeptidique

57 Streptococcus pneumoniae What do you think about this resistant phenotype ? PenicillinR ChloramphenicolS CotrimoxazoleS TetracyclineS ErythromycinS Is it possible ? - Yes ? - Not ?

58 ANSWER - Yes - Possible phenotype because some strains present an isolated resistance to penicillin

59 Streptococcus pneumoniae The frequency of resistance is: - Tetracycline30 % - Erythromycin53 % - Chloramphenicol11 % - Cotrimoxazole33 % - Fosfomycine4 % - Rifampin 0,5 % CNRP Rapport dactivité 2004

60 Concernant la résistance aux bêta-lactamines chez les pneumocoques -Limipénème est toujours plus actif que lamoxicilline? -Dans une méningite pourrait on utiliser limipénème, le méropénème? -Les céphalosporines de troisième génération peuvent être moins actives que lamoxicilline

61 Concernant la résistance oux bêta-lactamines chez pneumocoque -Limipénème est toujours plus actif que lamoxicilline? Oui -Dans une méningite pourrait on utiliser limipénème, le meropénème? Meropénème pourquoi pas hors AMM??? -Les céphalosporines de troisième génération peuvent être moins sensibles que lamoxicilline Oui CRO: 8/32 Peni 0.25/2-4 Moralité: Antibiogramme et CMI

62 Que pensez vous de cet antibiogramme chez S. pneumoniae ? 1 2 Erythromycin/Roxythomycin (C14)R R Azithromycin (C15)R S Spiramycine /Josamycine (C16)R S ClindamycinR S Télithromycin S S Vrai ou faux ?

63 MLSb Mef efflux France51%3-5 % Italy5-26 % Usa61 % Macrolides 14, 15R R Macrolides 16R S LincosamidesR S KetolidesS S Streptogramin (A + B) S S

64 Chez S. pneumoniae quel est lordre dactivité croissante des différentes fluoroquinolones ? Ciprofloxacine Péfloxacine Lévofloxacine Ofloxacine Moxifloxacine

65 Chez S. pneumoniae quel est lordre dactivité croissante des différentes fluoroquinolones ? Péfloxacine 8 Ciprofloxacine2 Ofloxacine1/2 Lévofloxacine 0.5/1 Moxifloxacine 0.25

66 Les mécanismes de R aux quinolones sont ils liés à la présence de: -Une ou plusieurs enzymes détruisant les Fqs ? -Mutation(s) dans la cible avec diminution daffinité ? -Efflux ?

67 Les mécanismes de R sont ils liés à la présence de: -Une ou plusieurs enzymes détruisant les Fqs ? Bifunctional acetyltransferase : AAC(6)-Ib-cr Bifunctional acetyltransferase : AAC(6)-Ib-cr Confers reduced susceptibility to aminoglycosides and fluoroquinolones (MIC of ciprofloxacin increased 3 fold) (Robicsek et al. Nat Med 2006) -Mutation(s) dans la cible avec diminution daffinité ? ADN Gyrase -Efflux-perméabilité ? Oui

68 A 30 year-old woman is treated for a pyelonephritis due to klebsiella pneumoniae. The antibiogramme is : AmpicillinR TicarcillinR Cephalotin (1st generation cephalosporin) S PiperacillinS The patient is treated by piperacillin, the fever persist, and the white blood count is /mm 3. Are you surprised ? - YES ? - NO ?

69 ANSWER - No - Impossible phenotype because: - K. pneumoniae harbor a natural chromosomal penicillinase for which piperacillin is a substrate

70 A protected brush specimen yield with > 10 3 UFC/ml of Enterobacter cloacae during a nosocomial pneumonia. The antibiogramme is: AmpicillinR TicarcillinS Cephalotin (1st generation cephalosporin) S A treatment with cephalotin is begun because the patient is allergic to penicillin. The evolution is bad. Are you surprised ? -YES ? - NO ?

71 ANSWER - NO, the phenotype is impossible because E. cloacae produce a natural chromosomal cephalosporinase. - Ampicillin and 1st generation cephalosporins are natural substrates for the cephalosporinase

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73 -lactamases most frequently present in clinical isolates Penicillinases Natural : klebsiella TEM ++++Enterobacteria Plasmidic : SHV ++ Cephalosporinases Natural : E. cloacae Citrobacter Serratia Pseudomonas Plasmidic: yes, but rare C P

74 E. COLI What do you think about this antibiogramme ? AmpicillinR TicarcillinR Cephalotin (1st generation cephal)I Amoxicillin- clavulanic acid I Possible ? - YES - NO

75 ANSWER : - YES - Possible: the strain hyperproduces a penicillinase

76 E. COLI AmpicillinR TicarcillinR Cephalotin (1st generation cephalosporin) S Amoxicillin- clavulanique acidR Possible ? - YES ? - NO ?

77 ANSWER Possible: IRT (inhibitor resistant TEM) strain

78 TEM IRT Mutation I I

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82 The antibiogramme of a Pseudomonas aeruginosa strain responsible for a nosocomial urinary tract infection is as follow: TicarcillinS PiperacillinS CeftazidimeS ImipenemI Is it possible ? - YES or - NO

83 ANSWER : - Possible phenotype - Resistance to imipenem due to the association of the loss of one specific porin (D2) and the production of cephalosporinase

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85 Cepase 12 to 20 % of the strains of Pseudomonas aeruginosa CEFTA IMI IMIPENEMS CEFTAZIDIME S RSRS

86 the different phenotypes of resistance in P. aeruginosa TICPIPCAZAZTIMP Wild type Penicillinase Cephalosporinase hyperproducing Non enzymatic resistance (eflux) Loss of porin D2 Complete by susceptible (S), Intermediate (I) or Resistant (R)

87 Phenotypes of resistance in P. aeruginosa TICPIPCAZAZTIMP SSSSSWild type RRSSSPenicillinase RRI/R SCephalosporinase hyperproducing ISSISNon enzymatic resistance (eflux) SSSSILoss of porin D2

88 Existe til des bêta-lactamases détruisant limipenème ?? Non? Pourquoi? Oui? Quelles espèces

89 Carbapénèmases dans le monde Classes A. NMC-A SME-1 SME-2 SME-3 IMI-1 KPC-1 GSE-1 France U.K U.S.A South Africa (E. cloacae) (S. marcescens) (E. cloacae) (K. pneumoniae) (P. aeruginosa) B. IMP-1 IMP-2 IMP3 VIM-1 VIM-2 (épidémie) Japon Italie Chine Italie France Italie Grèce (S. marcescens) (A. baumanii) (P.aeru., K. pneumoniae) (P. aeruginosa) D. OXA Belgique Singapour Portugal France(A. baumanii)

90 Est-ce vrai ? : les Bacteroides fragilis sont toujours sensibles à limipénème ? les Bacteroides fragilis sont toujours sensibles au métronidazole ? les Bacteroides fragilis sont toujours sensibles à la clindamycine ? les Bacteroides fragilis sont généralement sensibles à lamoxicilline ?

91 % de Résistance chez B. fragilis limipénème < 5% % métronidazole 1-2 % clindamycine 25 % lamoxicilline 90 % Augmentin 0 en 1980 / < 10 % actuellement


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