Master génie biologique : Module Nutrition Animale Année : 2013-2014 Mr BENSALAH.

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1 Master génie biologique : Module Nutrition Animale Année : 2013-2014 Mr BENSALAH

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3  Fonctionnement de l'estomac d'un ru - La vache a quatre estomacs qui lui permettent de ruminer. La rumination est la première étape de l'alimentation des bovins, mais aussi de nombreux animaux sauvages ou domestiques dénommés ruminants (les cerfs, les zébus, les buffles, les moutons, chèvres, mouflons…). Au pré, un bovin rumine de 8 à 12 heures par jour. La rumination est lente et se décompose en différentes étapes, au cours desquelles les aliments font des allers-retours entre la bouche et les premiers des quatre estomacs que possède la vache : - *la panse ou rumen, - *le réseau ou bonnet, - *le feuillet ou livret, - *la caillette.  Fonctionnement de l'estomac d'un ruminant - La vache a quatre estomacs qui lui permettent de ruminer. La rumination est la première étape de l'alimentation des bovins, mais aussi de nombreux animaux sauvages ou domestiques dénommés ruminants (les cerfs, les zébus, les buffles, les moutons, chèvres, mouflons…). Au pré, un bovin rumine de 8 à 12 heures par jour. La rumination est lente et se décompose en différentes étapes, au cours desquelles les aliments font des allers-retours entre la bouche et les premiers des quatre estomacs que possède la vache : - *la panse ou rumen, - *le réseau ou bonnet, - *le feuillet ou livret, - *la caillette.

4 La rumination : pour ne pas consommer sur place Pour que la rumination commence, il faut que la vache se nourrisse. Quand elle broute, elle ne va pas beaucoup mâcher son herbe, mais plutôt l'avaler sous forme de brins assez longs. Ces brins descendent dans l'œsophage et tombent dans le réseau, d'où ils vont directement dans la panse (toutes les minutes). Une fois que la vache a brouté une grande quantité d'herbe, elle va se coucher au calme. C'est à ce moment-là que la rumination vraie commence. De la panse, les gros brins d'herbe vont être renvoyés vers la bouche, grâce à une contraction du réseau synchronisée avec l'œsophage. De retour dans la bouche, ce bol alimentaire va être mâchonné longtemps. Cette mastication réduit la dimension des particules d'herbe. Pendant cette étape, une forte quantité de salive vient se mélanger à l'herbe : lorsque la vache mastique entre 6 et 8 heures par jour, elle produit entre 160 et 180 litres de salive. La rumination : pour ne pas consommer sur place Pour que la rumination commence, il faut que la vache se nourrisse. Quand elle broute, elle ne va pas beaucoup mâcher son herbe, mais plutôt l'avaler sous forme de brins assez longs. Ces brins descendent dans l'œsophage et tombent dans le réseau, d'où ils vont directement dans la panse (toutes les minutes). Une fois que la vache a brouté une grande quantité d'herbe, elle va se coucher au calme. C'est à ce moment-là que la rumination vraie commence. De la panse, les gros brins d'herbe vont être renvoyés vers la bouche, grâce à une contraction du réseau synchronisée avec l'œsophage. De retour dans la bouche, ce bol alimentaire va être mâchonné longtemps. Cette mastication réduit la dimension des particules d'herbe. Pendant cette étape, une forte quantité de salive vient se mélanger à l'herbe : lorsque la vache mastique entre 6 et 8 heures par jour, elle produit entre 160 et 180 litres de salive.

5 Le rumen (ou panse) est de loin le plus volumineux des pré-estomacs (environ 100 litres chez un bovin adulte pesant de 500 à 600 kg); il représente plus de 90% de leur volume total. Les autres pré-estomacs sont le réseau (ou bonnet) et le feuillet. L'ensemble rumen et réseau, souvent assimilé au rumen, présente toutes les caractéristiques essentielles d'un "fermenteur". Les conditions ambiantes sont définies par: Le rumen (ou panse) est de loin le plus volumineux des pré-estomacs (environ 100 litres chez un bovin adulte pesant de 500 à 600 kg); il représente plus de 90% de leur volume total. Les autres pré-estomacs sont le réseau (ou bonnet) et le feuillet. L'ensemble rumen et réseau, souvent assimilé au rumen, présente toutes les caractéristiques essentielles d'un "fermenteur". Les conditions ambiantes sont définies par: · un milieu riche en eau (85 à 90%),· un apport régulier de nutriments fournis à la fois par l'ingestion des aliments et par la rumination (ainsi que par le recyclage de l'urée), · un milieu riche en eau (85 à 90%),· un apport régulier de nutriments fournis à la fois par l'ingestion des aliments et par la rumination (ainsi que par le recyclage de l'urée), · un pH élevé (6,4 à 7,0) tamponné par l'apport de minéraux (bicarbonates et phosphates) de la salive, · un pH élevé (6,4 à 7,0) tamponné par l'apport de minéraux (bicarbonates et phosphates) de la salive, · une température de 39 à 40°C, · une température de 39 à 40°C, · une élimination continue des produits terminaux de la digestion microbienne, · une élimination continue des produits terminaux de la digestion microbienne, · des échanges permanents à travers la paroi du rumen. · des échanges permanents à travers la paroi du rumen.

6 Les micro-organismes du rumen Ces conditions sont propices au développement d'une population de micro- organismes (appelés aussi microbes du rumen), caractérisée par sa variété et sa densité. On y trouve: Ces conditions sont propices au développement d'une population de micro- organismes (appelés aussi microbes du rumen), caractérisée par sa variété et sa densité. On y trouve: · des bactéries au nombre de 10 9 à 10 10 par ml de contenu de rumen et composée essentiellement de bactéries anaérobies strictes qui constituent plus de la moitié de la biomasse microbienne totale. Elle comprend plusieurs variétés de bactéries selon qu'elles sont cellulolytiques, amylolytiques, protéolytiques ou uréolytiques.· des protozoaires, surtout des ciliés anaérobies, dont la population est comprise entre 10 5 et 10 6 individus/ml de contenu de rumen. · des bactéries au nombre de 10 9 à 10 10 par ml de contenu de rumen et composée essentiellement de bactéries anaérobies strictes qui constituent plus de la moitié de la biomasse microbienne totale. Elle comprend plusieurs variétés de bactéries selon qu'elles sont cellulolytiques, amylolytiques, protéolytiques ou uréolytiques.· des protozoaires, surtout des ciliés anaérobies, dont la population est comprise entre 10 5 et 10 6 individus/ml de contenu de rumen. · des champignons anaérobies, plus fréquents chez les ruminants tropicaux (où, selon BAUCHOP (1979), ils sont au nombre de 10 3 /ml de contenu de rumen) que les ruminants tempérés. · des champignons anaérobies, plus fréquents chez les ruminants tropicaux (où, selon BAUCHOP (1979), ils sont au nombre de 10 3 /ml de contenu de rumen) que les ruminants tempérés.

7 Mycoplasmes, virus et bactériophages Ils sont présents dans le rumen mais leurs rôles restent à élucider surtout pour les mycoplasmes.Selon Thivend et al., 1985, les bactériophages tempérés et virulents peuvent jouer un rôle dans l’écologie du rumen.A la suite d’une infection par un phage virulent, une espèce bactérienne peut devenir sous dominante Son action pourra cependant être compensée par la prolifération d’une espèce non sensible, capable d’occuper la même niche écologique Mycoplasmes, virus et bactériophages Ils sont présents dans le rumen mais leurs rôles restent à élucider surtout pour les mycoplasmes.Selon Thivend et al., 1985, les bactériophages tempérés et virulents peuvent jouer un rôle dans l’écologie du rumen.A la suite d’une infection par un phage virulent, une espèce bactérienne peut devenir sous dominante Son action pourra cependant être compensée par la prolifération d’une espèce non sensible, capable d’occuper la même niche écologique

8 Les produits terminaux de cette fermentation sont, Les produits terminaux de cette fermentation sont, · les acides gras volatils (AGV): essentiellement l'acide acétique, l'acide propionique et l'acide butyrique, dont les proportions dépendent de la nature des glucides alimentaires,· le gaz carbonique et le méthane. · les acides gras volatils (AGV): essentiellement l'acide acétique, l'acide propionique et l'acide butyrique, dont les proportions dépendent de la nature des glucides alimentaires,· le gaz carbonique et le méthane. Les acides gras volatils, issus de la fermentation ruminale, sont absorbés dans le sang surtout à travers la paroi du rumen. Ils constituent la principale source d'énergie pour l'animal hôte puisqu'ils fournissent de 70 à 80% de l'énergie totale absorbée chez le ruminant (VERMOREL, 1978). Rappelons, par opposition, que le monogastrique tire son énergie essentiellement du glucose et des lipides alimentaires absorbés au niveau de l'intestin grêle. Les acides gras volatils, issus de la fermentation ruminale, sont absorbés dans le sang surtout à travers la paroi du rumen. Ils constituent la principale source d'énergie pour l'animal hôte puisqu'ils fournissent de 70 à 80% de l'énergie totale absorbée chez le ruminant (VERMOREL, 1978). Rappelons, par opposition, que le monogastrique tire son énergie essentiellement du glucose et des lipides alimentaires absorbés au niveau de l'intestin grêle.

9 Introduction Rumen = Ecosystème complexe favorable aux développements des micro-organismes anaérobies stricts Nécessité de développer des techniques du suivi des populations bactériennes pour trouver une alternative aux dénombrements en culture :

10 -Nature complexe de la microflore et de ces exigences -Nature complexe de la microflore et de ces exigences nutritionnelles, nutritionnelles, - réalisation de conditions d’anaérobiose parfaite, - réalisation de conditions d’anaérobiose parfaite, - Certaines bactéries sont réfractaires à la culture, - Certaines bactéries sont réfractaires à la culture, - Bactéries associées en chaînettes dénombrées - Bactéries associées en chaînettes dénombrées comme étant une seule bactérie, comme étant une seule bactérie, - Techniques lourdes à réaliser. - Techniques lourdes à réaliser.

11 Dénombrement à l’Acridine orange Dénombrement à l’Acridine orange Echantillon de jus rumen filtré sur grille métallique (maille Echantillon de jus rumen filtré sur grille métallique (maille 1 mm2) pour éliminer les grosses particules végétales 1 mm2) pour éliminer les grosses particules végétales Fixation dans du formol 4% en PBS Fixation dans du formol 4% en PBS Centrifugation et Lavages dans PBS Centrifugation et Lavages dans PBS Réalisation de dilutions Réalisation de dilutions Chaque dilution reçoit 1 ml d’Acridine orange 1% (P/V) Chaque dilution reçoit 1 ml d’Acridine orange 1% (P/V) Temps de coloration de dix minutes Temps de coloration de dix minutes Le complexe bactérie-acridine orange est filtré sous vide Le complexe bactérie-acridine orange est filtré sous vide Les filtres sont séchés puis montés entre lame et lamelle Les filtres sont séchés puis montés entre lame et lamelle et observés en épifluorescence au microscopique et observés en épifluorescence au microscopique photonique (Olympus BH2) à l’objectif à immersion (x 100) 4 photonique (Olympus BH2) à l’objectif à immersion (x 100) 4

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13 Figure 1 : Cellules bactériennes du jus du rumen observées au Figure 1 : Cellules bactériennes du jus du rumen observées au microscope photononique (x 1000) après coloration à l’acridine microscope photononique (x 1000) après coloration à l’acridine 5 orange 5 orange

14 Le nombre de bactéries par millilitre d’échantillon (N) Le nombre de bactéries par millilitre d’échantillon (N) est calculé selon la formule suivante : est calculé selon la formule suivante : N = n x S. d/s ou N = n x S. d/s ou n = moyenne de bactéries comptées dans 10 champs n = moyenne de bactéries comptées dans 10 champs oculaires oculaires S = surface filtrante S = surface filtrante s = surface d’un champ oculaire s = surface d’un champ oculaire d = dilution réalisée sur l’échantillon d = dilution réalisée sur l’échantillon N = nombre de bactéries / ml N = nombre de bactéries / ml

15 Figure 2: Dénombrement de la flore totale dans le jus du rumen de mouton par culture Figure 2: Dénombrement de la flore totale dans le jus du rumen de mouton par culture

16 Dénombrement par immunofluorescence indirecte Dénombrement par immunofluorescence indirecte II.1- Manipulation II.1- Manipulation II.1.1 Souches utilisées II.1.1 Souches utilisées Ruminococcus albus 7; R. flavefaciens 007; Fibrobacter Ruminococcus albus 7; R. flavefaciens 007; Fibrobacter succinogenes S85 ; Streptococcus bovis FD10 ; succinogenes S85 ; Streptococcus bovis FD10 ; Methanobrevibacter ruminantium Mr ; Selenomonas Methanobrevibacter ruminantium Mr ; Selenomonas ruminantium WPL ; Eubacterium limosum 20543 ; E. ruminantium WPL ; Eubacterium limosum 20543 ; E. cellulosolvens C; Butyrivibrio fibrisolvens D1; Lachnospira cellulosolvens C; Butyrivibrio fibrisolvens D1; Lachnospira multiparus LM multiparus LM

17 II.1.2- Production Anticorps polyclonaux Culture de la souche bactérienne (16 à 18 h) Fixation dans du formol/lavage Mélange (Culture et Adjuvant de Freund; 1:1) Lapin non immunisé Rappel 9 Prélèvement sanguin (artère central de l’oreille) injection 15 jours

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19 Immunofluorescence Indirecte Echantillon de jus rumen filtré Echantillon de jus rumen filtré Fixation dans du formol 4% en PBS Fixation dans du formol 4% en PBS Centrifugation et Lavages dans PBS Centrifugation et Lavages dans PBS Réalisation de dilutions dans des tubes Eppendorf Réalisation de dilutions dans des tubes Eppendorf Chaque dilution reçoit reçoit 20 µl d’une solution de sérum de chèvre pour saturer les sites non spécifiques puis incubée à 37°C pendant 1heure Chaque dilution reçoit reçoit 20 µl d’une solution de sérum de chèvre pour saturer les sites non spécifiques puis incubée à 37°C pendant 1heure

20 20 µl de l’anticorps primaire produit chez le lapin, dilué 20 µl de l’anticorps primaire produit chez le lapin, dilué au 1/100ème sont ajoutées et incubées pendant 1 au 1/100ème sont ajoutées et incubées pendant 1 heure à 37°C heure à 37°C Centrifugations et Lavages dans PBS Centrifugations et Lavages dans PBS 20µl d’anticorps anti-IgG de lapin marqué à 20µl d’anticorps anti-IgG de lapin marqué à l’Isothiocyanate de fluorescéine- l’Isothiocyanate de fluorescéine- Le complexe bactérie-Anticorps primaire- Anticorps Le complexe bactérie-Anticorps primaire- Anticorps secondaire est filtré et dénombré de la même manière secondaire est filtré et dénombré de la même manière que pour la technique à l’acridine orange que pour la technique à l’acridine orange

21 Figure 3 : Observation au microscopique de Ruminococcus albus 7 (x 1000) dans le jus de rumen après traitement par Figure 3 : Observation au microscopique de Ruminococcus albus 7 (x 1000) dans le jus de rumen après traitement par immunofluorescence indirecte. (les cocci immunofluorescence indirecte. (les cocci fluorescentes correspondent aux cellules ayant fixé les fluorescentes correspondent aux cellules ayant fixé les anticorps marqués à l’isothiocyanate de fluorescéine). anticorps marqués à l’isothiocyanate de fluorescéine). vertes Ben Salah M. FST Beni Mellal, Congré sur les Biotechnologies, Marrakech- 2003 vertes Ben Salah M. FST Beni Mellal, Congré sur les Biotechnologies, Marrakech- 2003

22 Conclusion Les deux techniques de dénombrement de bactéries du Les deux techniques de dénombrement de bactéries du rumen mises au point dans ce travail peuvent présenter rumen mises au point dans ce travail peuvent présenter une bonne alternative aux dénombrements sur milieux une bonne alternative aux dénombrements sur milieux de culture de culture Choix des milieux sélectifs Choix des milieux sélectifs Utiles dans les études microbiennes dans le des interactions Utiles dans les études microbiennes dans le des interactions rumen rumen Additifs alimentaires Additifs alimentaires Améliorer la digestibilité et par conséquent la production de Améliorer la digestibilité et par conséquent la production de Lait et de viande. Lait et de viande.