Thèse présentée par Emilie Loreau

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1 Thèse présentée par Emilie Loreau
Identification de gènes impliqués dans le développement des lymphomes cutanés primitifs CD30+ Laboratoire d’Histologie et Pathologie Moléculaire des Tumeurs EA Université Victor Ségalen Bordeaux 2 Directeur de thèse : Jean Philippe Merlio

2 Lymphomes Définition Lymphoproliférations CD30+
Prolifération maligne de lymphocytes B ou T Localisation principale dans les tissus lymphoïdes Monoclonalité Lymphoproliférations CD30+ Lymphome cutané primitif (LCP) CD30+ Papulose lymphomatoïde (Ply) Lymphome systémique CD30+ Peau Ganglion Les lymphomes sont des proliférations malignes de lymphocytes B ou T. Ils sont principalement localisés dans les tissus lymphoïdes. Le diagnostic de lymphome est donné selon différents aspects (clinique, évolutif, morphologique, cytologique et architecturaux), mais repose essentiellement sur la mise en évidence d’une monoclonalité. Ces proliférations correspondent à des expansions monoclonales de lymphocytes B ou T à différents stades de maturation, ce qui génère différents types de lymphomes. Parmi les lymphoproliférations exprimant l’antigène de surface CD30, nous retrouvons deux pathologies localisées dans la peau : le LCP CD30+ et la Ply ; et une localisée dans les ganglions : le L. systémique CD30+. Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

3 Antigène de surface CD30 Récepteur transmembranaire (120 kDa) Fonction
NF-KB CD30L CD30 Membrane plasmique MAPK TRAF Famille du TNF-R Expressions - Lymphocytes T activés sanguins (15%) - Lymphoproliférations CD30+ L’antigène de surface CD30 est un récepteur transmembranaire de 120 kDA qui appartient à la famille du Récepteur TNF. On retrouve son expression dans les lymphocytes sanguin, T activés qui correspondent à environ 15% des lymphocytes T sanguins et dans les lymphoproliférations CD30+. Lorsque le CD30L se fixe à son récepteur, il y a un regroupement des récepteurs à la surface de la membrane plasmique. Au niveau cytoplasmique, les protéines TRAF sont recrutées et la signalisation se poursuit dans la cellule. Les protéines TRAF peuvent par exemple activer les voies de signalisation des MAPK ou encore de NF-KB. Relire MORI, CD30L exprimé lors de régression des lymphomes. Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

4 Lymphome cutané primitif CD30+
Classification 9 % des lymphomes cutanés primitifs (EORTC) Clinique Tumeur cutanée, régression spontanée, récidive Age 60 à 70 ans Pronostic Survie à 5 ans 95%, si extension extra-cutanée 25% Histologie Non épidermotrope, infiltrat dense Phénotype Lymphocytes T exprimant le CD30+ (70 %) Génotype Réarrangement clonal du gène du TcR : (70 %) Le lymphome cutané primitif CD 30+ correspond à 9% des LCP selon la classification de l’EORTC. C’est un lymphome qui n’est pas agressif et qui se caractérise chez certains patients par des phénomènes de régressions spontanée et par des récidives. L’age moyen d’apparition de cette maladie est de ans, avec une survie très favorable 95% à 5 ans, sauf en cas d’extension extra cutanée, on tombe alors à 25%. Au niveau histologique, on note un infiltrat dermique dense de grandes cellules, de phénotype T et exprimant l’antigène de surface CD30 pour 70% des cellules. On note également un réarrangement clonal du TcR. Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

5 Prolifération tumorale
Lymphome cutané primitif CD30+ Peau Saine LCP CD30+ Hypoderme Derme Epiderme Epiderme Derme Prolifération tumorale Patient Au milieu, nous avons la photo d’un patient atteint d’un LCP CD30+ ; il présente une tumeur unique, localisé au niveau de la joue. La photo de gauche représente une coupe histologique de peau saine. Avec ici l’épiderme, le derme et l’hypoderme La photo de droite correspond à une coupe histologique de la tumeur du patient présenté ici : On voit bien la prolifération dense des lymphocytes T CD 30+, elle envahie le derme. Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

6 Cellules inflammatoires Atteinte extra-cutanée
Papulose lymphomatoïde / LCP CD30+ Ply type A Ply type C Autre cas frontière LCP CD30+ Histologie Cellules CD30+ Cellules inflammatoires dispersées nombreuses en amas +/- rares Clinique Lésions Distribution Evolution Régression spontanée Atteinte extra-cutanée toujours exceptionnelle 50 % rare 30 % 25 % papule>nodule généralisée nodule>tumeur loco-régionale La Ply forme avec le LCP CD30+ un spectre continu. Au niveau histologique, la Ply de type A est composées de cellules CD30+ dispersée et de nombreuses cellules inflammatoires tandis que le LCP CD30+ contient des cellules CD30+ regroupées en amas et quelques cellules inflammatoires. La clinique est également différente pour ces deux pathologie : la PLy présente des lésions allant de la papule au nodule avec une distribution généralisée tandis que le LCP CD30+ présente des lésions plus volumineuses allant du nodule à la tumeur, avec une répartition loco-régionale. Les cas frontières sont des pathologies qui ont une présentation histologique de Ply avec une clinique de LCP CD30+ ou une histologie de lymphome avec une clinique de Ply. Il n’existe pas de consensus international, ni de standards permettant de différentier ces différents pathologies et notamment pas de critère moléculaire. Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

7 L. systémique CD30+ / LCP CD30+
Age Bimodal : 20 et 70 ans 60 à 70 ans Clinique Agressif Atteinte extra-ganglionnaire, osseuse ou cutanée (20/30 %) Non agressif Tumeur cutanée souvent localisée Atteinte extra-cutanée, ganglionnaire (25 %) Histologie Infiltrat diffus détruisant l’architecture du ganglion Infiltrat dense non épidermotrope Phénotype T, nul ou rarement B, CD30+ T ou nul, CD30+ Génotype Réarrangement clonal du TcR t(2;5) > 50 % Réarrangement clonal du TcR Pronostic : survie à 5 ans 77 % chez le sujet jeune 54 % pour les sujets âgés 95 % Extension extra-cutanée : 25 % Le diagnostic peut également être problématique entre L. systémique CD30+ et LCP CD30+. Ce tableau présente les points communs et les différences qui existent entre ces deux pathologies. Les similitudes sont d’une part l’age des patients, autour de 70 ans. D’autre part, ces deux pathologies sont composées de Lymphocytes T exprimant le CD30. La localisation des tumeurs peut porter à confusion, en effet, le L. ganglionnaire peut avoir des extension vers la peau. De même le LCP CD30+ peut avoir des extensions ganglionnaires. Au niveau génomique, on retrouve dans plus de 50% des cas de L. systémique CD30+ la t(2;5). Elle conduit à l’expression de l’oncogène NMP dans les cellules tumorales. Cette translocation n’est pas retrouvée dans les LCP CD30+. Il est important de distinguer ces deux pathologies puisque le pronostique vital est très favorable dans le cas du LCP CD30+, avec une survie à 5 ans de 95%, tandis qu’elle est moins favorable pour le L. systémique CD30+, avec une survie à 5 ans de 54 %. Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

8 Gènes et cancers  Oncogène  Gène suppresseur de tumeur …
Colon sain  Oncogène Activation du cycle cellulaire Inhibition de l’apoptose Mutation dominante  Gène suppresseur de tumeur Inhibition du cycle cellulaire Activation de l’apoptose Mutation récessive  APC  K-Ras  DCC  p53 … Cancer L’apparition et le développement d’un cancer est régit par deux grandes familles de gènes : Les oncogènes qui vont favoriser la prolifération cellulaire soit en activant le cycle cellulaire soit en inhibant l’apoptose. Et les gènes suppresseur de tumeur qui agissent comme un frein sur la prolifération cellulaire, en inhibant le cycle cellulaire ou encore en activant des voies pro-apoptotiques. L’altération des ces gènes dans une cellule peut conduire à un cancer. Les mutations sont dominantes pour les oncogènes et généralement récessives pour les gènes suppresseur de tumeur. L’apparition d’un cancer résulte d’un processus combinatoire : il faut une accumulation de plusieurs altérations, comme illustré dans ce schéma pour le cancer du colon. Cancer + Métastases Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

9 Etude du transcriptome
Objectif  Oncogenèse du LCP CD30+ ? Aide au diagnostic Cible thérapeutique Voies de transduction Etude du transcriptome Au regard de la littérature, nous pouvons considérer que l’oncogenèse des LCP CD30+ reste inconnue, en effet la t(2;5) n’est pas retrouvée dans cette pathologie. L’objectif de ma thèse est d’identifier des gènes impliqués dans les LCP CD30+. Pour ce faire, nous avons choisi d’étudier le transcriptome. Cette étude peut avoir plusieurs intérêts : L’identification de marqueur pour le diagnostic. De plus, ces gènes pourront servir à plus long terme de cible thérapeutique. Cette étude permettra également d’étudier des voies de signalisation impliquées dans les LCP CD30+ Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

10 Etude du transcriptome
Approches globales Puce à ADNc mRNA differential display SSH « Substractive Suppressive Hybridization » Approches ciblées RT-PCR RT-PCR en temps réel L’étude du transcriptome peut se faire par des approches dites globale, ie qu’on regarde en même temps l’ensemble des ARN exprimés dans un type cellulaire donné. Ou encore de manière ciblée, lorsqu’on connaît le gène à étudier. Ce n’est pas le cas pour le LCP CD30+, aussi nous avons commencé par une approche globale. En fonction des possibilités locale et de l’expérience du laboratoire du Pr. JPM, nous avons utilisé la SSH pour l’étude du transcriptome des LCP CD30+. Je détaillerai cette technique dans la suite de mon exposé. En effet, la mRNAdd avait déjà été utilisée, mais les résultats n’étaient pas concluant, en effet de nombreux clones correspondaient à des régions 3’ UTR. Nous avons également utilisé une approche ciblée sur les gènes issus de la SSH : la RT-PCR en temps réel. Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

11 Stratégie  Banque soustraite  Macro-array  RQ-PCR ?
Réalisation de banques par SSH Criblage des banques Validation des gènes candidats La stratégie choisi pour connaître le transcriptome des LCP CD30+ est la suivante : Dans un premier temps j’ai réalisé des banques soustraites par la technique SSH. Ces banques sont ensuite criblées par macro-array afin de diminuer le nombre de faux positif. Les gènes candidats sont enfin validé par RT-PCR en temps réel. Le déroulement de mon exposé suivra cette stratégie Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

12 Principe de la SSH But Mise en évidence de gènes spécifiques d’une population cellulaire  Comparaison de deux populations cellulaires différentes : tester et driver  Gènes spécifiques de la population cellulaire tester La SSH permet de comparer deux populations cellulaires distinctes, communément appelées Tester et Driver, et de mettre en évidence des gènes spécifiques de la population Tester. Cette technologie combine deux propriétés importante : d’une part une normalisation des ARNm fortement ou faiblement représentés ; d’autre part une suppression des ARNm présent dans les deux populations. Normalisation entre les ARNm fortement ou faiblement représentés Suppression des gènes présents dans les deux populations Diatchenko et al, 1996 Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

13 Etapes de la SSH  RT  RsaI  Hybridations  PCR  Ligation  Clonage
AAAA  RT  RsaI tester ou driver  Ligation Les principales étape d’une SSH sont représentée ici. Pour les deux populations tester et driver, on commence par une RT selon la technologie SMART. Les ADNc db sont ensuite digéré par RsaI, cet enzyme génère des molécules de 500 pb environ. A ce niveau le driver est terminé, il est mis de coté jusqu’à l’hybridation. Le tester est partagé en deux et chaque fraction est liée avec un adaptateur différent. La quatrième étape correspond aux hybridation soustractives entre les tester et le driver, puis deux PCR successives sont réalisé. Le produit de la seconde PCR sera cloné dans un plasmide pour générer la banque soustraite. tester Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

14 SSH H1a a b c d Ex a b c d e PCR1 a, c et d b Tester 1 Tester 2R
Driver a b c d + e H2 PCR2 H1b Cette diapo reprend en détail les étape d’hybridation et de PCR. Nous partons donc de trois population d’ADNc qui sont le tester lié à l’ad 1, le driver et le tester lié à l’ad 2R. Après dénaturation des différents ADNc, nous réalisons deux hybridations en parallèle. La première entre le tester 1 et un excès de driver, la seconde entre le tester 2R et un excès de driver. Nous obtenons les formes a, b, c et d. Une seconde hybridation est réalisée sans dénaturation préalable entre les produits des deux premières hybridation et un excès de driver. Nous obtenons les mêmes formes que précédemment avec en plus la forme e. elle correspond à un ADNc présent uniquement dans le tester donc à un gène que nous cherchons à isoler. Après extension des amorces, deux PCR sont réalisée. La première avec les amorces externe permet d’amplifier spécifiquement les ADNc de type c. En effet, les forme d ne sont pas amplifiées puisqu’elles n’ont pas d’adaptateurs. Les formes a et c, possédant seulement un adaptateur, sont amplifiées de manière linéaire. Les formes b, possédant le même adaptateur aux deux extrémités ne sont pas amplifiées car le repliement intramoléculaire est favorisé par rapport à l’hybridation des amorces PCR sur les adaptateurs. La seconde PCR permet de diminuer le nombre de faux positifs. Nous obtenons ainsi une banque d’ADNc enrichie en ADNc spécifiques de la population tester. Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

15 Choix des échantillons
Tester Driver Prélèvement de la tumeur cutanée Lymphocytes tumoraux ARN totaux Prise de sang Lymphocytes sanguins ARN totaux 18S 28S ARN dégradés Afin de mettre en évidence des gènes spécifiques des LCP CD30+, nous avons choisi les échantillons suivant : Le tester correspond aux lymphocytes tumoraux. Il sont obtenu à partir de la biopsie cutanée d’un patient atteint de LCP CD30+. On réalise quelques coupes histologiques afin de localiser l’épiderme, et on l’élimine par macro-dissection. Les ARN totaux sont enfin extrait. Pour le driver nous avons choisi d’utiliser des lymphocytes sanguin obtenu par prise de sang sur un patient sain. ie patient ne présentant aucune maladie lymphoproliférative. En effet les lymphocytes sanguin sont constitué en majorité de lymphocytes de phénotype T (70%). La qualité des ARN totaux est estimée sur gel d’agarose, chaque piste correspond à une extraction d’ARN différentes. Ici nous avons des ARN de bonne qualité, on note la présence de 2 bandes majeur correspondant aux ARN ribosomaux 28 et 18S. Ici nous avons des ARN fortement dégradés qui ne sont pas utilisable. Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

16 SSH Etapes critiques Digestion des ADNc par RsaI (tester et driver)
1 2 Digestion des ADNc par RsaI (tester et driver) Gel d’agarose 1,2 % w/v ADNc non digéré ADNc digéré Ligation des adaptateurs pour créer deux populations tester Gel d’agarose 2 % w/v Marqueur PM 100 pb Tester 1, lié Tester 1, lié ou non tester 2R, lié tester 2R, lié ou non La réalisation d’une SSH est dépendant de la qualité des ADNc tester et driver. Deux étapes sont critiques pour que la normalisation et la suppression aient lieu. D’une part la digestion par RsaI doit être de bonne qualité. Elle est contrôlée par migration sur un gel d’agarose. Nous avons ici l’ADNc non digéré et l’ADNc digéré. On voit bien la diminution du smear. D’autre part la ligation des adaptateurs doit être d’au moins de 25%. La photo du bas correspond au contrôle qualité de l’efficacité de ligation des adaptateurs pour les deux populations tester. Par exemple, la piste 3 correspond à la population d’ADNc tester total et la piste 2 aux ADNc tester qui ont lié l’adaptateur 1. En comparant ces deux signaux, on voit qu'environ 40% des molécules sont liées à l’adaptateur 1. Introduction Introduction Banque SSH Banque SSH Criblage banque Criblage banque Validation candidats Validation candidats Conclusion Conclusion

17 Validation d’une banque SSH
S NS S NS M Efficacité de soustraction Soustrait Non Soustrait S NS PCR1 PCR2 8 SSH réalisées 3 SSH validées 4 SSH criblées La première photo permet de vérifier la qualité des amplifications PCR1 et PCR2, réalisées après l’hybridation soustractive. Nous avons ici un zoom sur les produits de PCR2 soustrait et non soustrait et le produit soustrait sera cloné dans un plasmide, le pGEM-T. Ces produits permettent également de vérifier l’efficacité de la soustraction. Pour ce faire, nous regardons par PCR la quantité d’un gène de ménage, la GAPDH. Si la soustraction a bien eu lieu, le gène de ménage doit être moins présent dans le produit soustrait par rapport au produit non soustrait. C’est ce que nous voyons sur cette photo, avec 5 cycles de différence. Au cours de ma thèse j’ai réalisé 8 SSH dont trois ont été validées. Quatre de ces SSH ont été ensuite criblées. En fait la première SSH a été criblée même si son efficacité de soustraction été nul, afin de mettre au point les protocoles de criblage. Clonage dans le pGEM T vector Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

18 Criblage des banques soustraites
S NS But Diminuer le nombre de faux positifs PCR2 Organisation des banques sur membranes Clonage T C G A Séquençage Hybridation des sondes radioactives Nous passons maintenant au criblage des banques soustraites. Il permet de diminuer le nombre de faux positifs. Les principales étapes du criblage sont les suivantes : On part du produit de PCR2 qui est cloné dans le vecteur pGEM-T de Promega. Des bactéries sont transformées et les clones sont ensuite organisées. Les différents clones sont mis sur des membranes de nylon et nous fabriquons deux membranes identiques. La première membrane est hybridée avec une sonde tumorale et la seconde avec une sonde non tumorale. Seul les clones présentant un signal fort avec la sonde tumorale et pas ou peu de signal avec la sonde non tumorale sont sélectionnés et séquencés. Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

19 A partir des clones  Organisation des clones en deux boites homologues : grille à 228 positions  Transfert des bactéries sur membrane de nylon  Fixation de l’ADN des bactéries sur les membranes  Hybridation des sondes radio-marquées Sonde tumorale Sonde non tumorale Au début de ma thèse nous avons directement travaillé avec les clones bactériens. Après transformation, chaque clone bactérien est repiqué sur deux géloses selon une grille à 228 positions. Les bactéries sont mises à pousser une nuit à 37°C puis elles sont transférées sur des membranes de nylon. L’ADN contenu dans les bactéries est ensuite fixé au membrane et l’hybridation des sondes radio-actives est enfin réalisée. … Cette technique de criblage a générer environ 30% de clones non analysable Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

20 Par Dot Blot  Organisation des clones dans des plaques de 96 puits
 PCR à partir des clones en suspension (amorces M13)  Fixation des produits de PCR sur deux membranes de nylon par Dot Blot  Hybridation des sondes radio-marquées Tumeur Non tumeur Nous avons ensuite réalisé le criblage à partir de produit de PCR spoté par Dot Blot … Par cette méthode l’ensemble des clones sont analysable Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

21 + Résultats du criblage 2230 spots 349 clones Criblage
118 gènes candidats Séquençage Bibliographie : 16 gènes PTTG1 Bcl11B CIN85 SPARC p120 cat Dot Blot : 15 gènes THW Humanine + Validation RQ-PCR Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

22 Importance du choix des échantillons
Résultats du criblage Kératine 6 Annexes cutanées Surexpression dans un environnement prolifératif ARN 18S Track de A Surexpression dans les cellules tumorales CMH II Fortement exprimé dans les lymphocytes T activés Parmi les 118 gènes, nous avons également retrouvé … Ces résultats montrent l’importance du choix des échantillons pour des études comparatives tel que la SSH Le fait de ne pas partir de population cellulaire pure tel que des lignées cellulaire peut générer des biais expérimentaux. Importance du choix des échantillons Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

23 Validation des candidats
But Vérifier par une autre technique les variations d’expressions PCR en temps réel ou RQ-PCR  Normalisation par PO (gène de ménage)  Quantification relative (tumeur par rapport à non tumeur) Augmenter le nombre d’échantillons testés La validation des gènes candidats a été réalisée par PCR en temps réel ou RQ-PCR. L’ensemble des résultats a été normalisé par le gène de ménage PO, je vous expliquerai plus tard comment nous avons choisi ce gène. Et nous avons regardé l’expression des gènes candidats de manière relative : tumeur par rapport à non tumeur. Du fait de la rapidité de cette technologie, par rapport à la SSH, nous avons pu augmenter le nombre des échantillons testés. Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

24 Transcription inverse
RT-PCR en temps réel Transcription inverse 11 cas de LCP CD30+ 7 tumeurs initiales 3 récidives 1 ganglion 2 cas de L. systémique CD30+ 7 lymphocytes sanguins sains Echantillons testés 2 g Nous avons testé … ALK+ Dans un premier temps, les ARN totaux sont retro-transcrit à partir d’hexamère puis l’ADNc sert de matrice à la PCR en temps réel. Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

25 RT-PCR en temps réel Amplification par PCR
Amplification avec des amorces spécifiques du gène d’intérêt Utilisation d’un intercalent fluorescent : le SYBR-Green Mesure de la fluorescence en fin d’élongation Intensité de fluorescence quantité de cible La synthèse du second brin d’ADNc est réalisé avec des amorces spécifiques d’un gène candidat ou du gène de ménage. Nous avons utilisé le SYBR Green qui est un intercalant fluorescent spécifique de l’ADN double brin. La mesure de la fluorescence est prise à chaque cycle, en fin d’élongation et nous pouvons directement relier l’intensité de fluorescence à la quantité de cible amplifiée. Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

26 Exemple de résultats Courbe de fusion Cinétique
3 mM 4 mM 5 mM Courbe de fusion T- 3 mM 5 mM 4 mM Cinétique Ct Nous avons ici un exemple de résultat de RQ-PCR : il correspond à la mise au point des conditions de RQ-PCR pour le gène de ménage PO. La spécificité de la PCR est vérifiée par la courbe de fusion qui permet de déterminer le Tm de chaque amplifia. Sur le schéma du bas, nous avons la cinétique de la PCR. Elle permet de déterminer pour chaque gène un Ct. Le Ct correspond au nombre de cycle où apparaît la cible [MgCl2] pour le gène PO Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

27 Choix d’un gène de ménage
 Choix des amorces : GAPDH, G6PD, PO, -actine  Etude sur 14 échantillons dont 4 tumeurs LCP CD30+  Travail en duplicate et en Ct Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

28 Choix d’un gène de ménage
Gène de ménage actine   Gène de ménage GAPDH Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

29 Gènes d’intérêts Gène de ménage PO
Analyse des résultats de RQ-PCR  RQ-PCR en duplicate sur chaque échantillon  Moyenne des Ct des duplicates (0,3)  Gamme de dilution [concentration arbitraire] Gènes d’intérêts Gène de ménage PO x Afin de quantifier l’expression d’un gène dans différents échantillons, nous réalisons une gamme de dilution de matrice. Pour chaque dilution nous réalisons une PCR, les résultats sont représenté dans le premier schéma. A partir de ces résultats, nous traçons une droite de la concentration arbitraire du gène en fonction du Ct. Puis nous regardons les Ct obtenus pour chaque échantillons, et nous avons leurs concentrations. On peut ainsi comparer la concentration d’un gène entre les différents échantillons, et voir s’il est plus exprimé dans les tumeurs ou non.  Normalisation : [Gène d’intérêt] [PO] Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

30 Résultats RQ-PCR relative
31 candidats étudiés sur 13 échantillons  THW (11)  p120 caténine (7)  SPARC (5)  PTTG1 (9) Surexpressions Sousexpressions  Humanine (9)  CIN85 (7)  Bcl11B (7) Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

31 Gènes Surexprimés - THW
THW et kératine 6 : même profil d’expression ! THW fortement exprimé dans les cellules épidermiques Gène suppresseur de tumeur Perte d’hétérozygotie fréquente en 6q Mélanome sans métastase : 10 à 20 % Mélanome avec métastases : 50 % Hildebrandt et al, 2000 et 2001 Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

32 Gènes Surexprimés - p120 caténine
Surexpression : cancer gastrique Sousexpression : autres cancers Noyau ? Kasio X p120 MP p120 E-cadhérine  cat actine  cat Quels sont les gènes inhibés dans les lymphocytes T ? Anastasiadis et Reynolds, 2001 Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

33 Gènes Surexprimés PTTG1 Oncogènes JUN-B surexprimé dans LCP CD30+
Tumeurs initiales (facteur 4) Récidives (facteur 8 à 15) c-jun SPARC AP1 Briggs et al, Mao et al, 2003 Glycoprotéine MEC Surexpression : certains cancers Surexpression : Lymphoproliférations T (70 %) Ségrégation des chromatides (mitose) PTTG1 Tumeurs initiales Pey et Melmed, Saez et al, 2002 Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

34 Délétions homozygotes Gène suppresseur de tumeur
Gènes sousexprimés Protéine doigt de zinc nucléaire Cerveau, système immunitaire Lymphomes du thymus (souris) : Délétions homozygotes Bcl11B Wakabayashi et al, 2003 Gène suppresseur de tumeur Protéine adaptatrice Prolifération/apoptose ? PI3K CIN 85 Apoptose (neurones) CIN85 Take et al, Gout et al, 2000 Hashimoto et al, Guo et al, 2003 Peptide anti-apoptotique (24 aa) Séquence homologue à l’ARN 16S Humanine Oncogène Apoptose Bax Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

35 Conclusion Quatre gènes surexprimés dans les LCP CD30+
SPARC et PTTG1 : oncogènes p120 caténine THW : biais expérimental (choix des échantillons de départ) Trois gènes sousexprimés Bcl11B : gène suppresseur de tumeur CIN85 Humanine Fonction oncogénique ou phénotype Mon travail de thèse à permis d’identifier 4 gènes surexprimés dans les LCP CD30+ dont deux oncogènes SPARC et PTTG1. Nous pouvons penser que ces oncogènes jouent un rôle dans les processus de lymphomagenèse impliqués dans les LCP CD30+. De plus SPARC et PTTG1 pourraient être utilisé comme marqueur pour distinguer les tumeurs initiales des récidives de LCP CD30+. Nous avons également mis en évidence une surexpression de la p120 caténine, mais nous ne pouvons pas conclure si cette surexpression résulte d’un phénotype du cancer ou a un rôle oncogénique. La surexpression de THW résulte quant à elle, d’un biais expérimentale. Ce résultat montre l’importance du choix des échantillon pour les approche comparatives tel que la SSH. Il est sûrement important de réaliser un trie cellulaire pour de futur études. Mais il faut alors espérer qu’on n’altère pas le phénotype des cellules lors du trie. Nous avons également mis en évidence trois gènes sousexprimés dont un gène suppresseur de tumeur, Bcl11B. Et au regard de la littérature nous pouvons penser qu’il intervient dans l’apparition ou le développement des LCP CD30+. La sousexpression de CIN85 peut également être impliquée dans cette pathologie, mais nous devrons vérifier dans quelle voie de signalisation elle intervient. Quant à la sousexpression de l’humanine, est-elle du à l’activation de voie de signalisation pro-apoptotique ou seulement un phénotype des LCP CD30+ ? Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

36 Perspectives Voies de signalisations impliquant les différents gènes
Augmenter le nombre des échantillons analysés : Marqueurs ? ISH ou microdissection : localisation des ARNm Immunohistochimie : localisation et niveau d’expression protéique SSH et CGH ? Voies de signalisations impliquant les différents gènes  CIN85 : recherche des partenaires - immunoprécipitation (prolifération ou apoptose)  JUN-B et SPARC  p120 et Kasio Les perspectives de ce travail sont dans un premier temps d’augmenter le nombre d’échantillons tester. En effet, l’étude de ces différents gènes sur une plus grande série de lymphoprolifération CD30+ pourra peut être aider au diagnostic différentiel par la mise en évidence de marqueur spécifiques. Des expériences d’IHS ou de microdissection couplée à la RQ-PCR doivent également être réalisée pour vérifier l’expression des gènes issu de ce travail dans les cellules CD30+. Cette étude porte uniquement sur les ARNm et il faut validé les variations d’expression au niveau protéique par des expériences d’immunohistochimie. On pourra également vérifier l’expression de ces protéines au niveau des cellules CD30+ par un double marquage immunohistochimique. Pour les différents gènes, nous souhaitons également étudier les voies de signalisations dont ils font partie. Par exemple en regardant par immunoprécipitation les partenaires de CIN85 dans les lymphocytes sanguins. Ou encore en vérifiant si la surexpression de SPARC est liée à une surexpression du facteur de transcription JUN-B, comme décrit dans la littérature. La p120 caténine joue aussi un rôle négatif sur la transcription de certain gène. La découverte des ces gènes dans les lymphocytes sanguins permettrait peut être de comprendre l’effet d’une sousexpression de la p120 caténine. Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

37 Remerciements Ce travail a été réalisé sous la direction du Pr. Jean Philippe Merlio Financement : Programme de Recherche Clinique d’Aquitaine Pr. Jacques Emile Bonnet Pr. Gilles Favre Pr. Pierre Brousset Laboratoire du Pr. Merlio Dr. Nathalie Carrère Jackie Ferrer Dr. Edith Chevret Laboratoire du Pr. De Mascarel Mme Beau Labo Bio Mol Pr. Marie Beylot Barry Dr. Béatrice Vergier Dr. Marie Parrens Endocube

38 Et aussi ! Martina Prochazkova Jean Christophe Cometta Pierre Dubus
Christine Bartoli Fanny Pelluard Cédric Barrière Nicolas Bitteau Michelle Turmo Armelle Bolzec Sylvain Caillol Dominique Bertheau Henri Gomez Christophe Barthe Lilian Marc Antoine Belaud Rotureau Alexis Groppi Peyo Jean Christophe Garoste Brigitte Tauzin Ma famille et mes amis pour leur soutien permanent