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Linterférence ARN une nouvelle approche pour inhiber l'expression des gènes. Perspectives en cancérologie INSERM EMI 104 CEA.

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1 Linterférence ARN une nouvelle approche pour inhiber l'expression des gènes. Perspectives en cancérologie INSERM EMI 104 CEA Grenoble

2 Comparaison entre différentes méthodes dinhibition de gènes MéthodesAvantagesInconvénients Knock-out animal Inhibition Complète du gèneLaborieux, cher, Des mutants létaux peuvent empêcher le développement embryonnaire Petites molécules introduction facile Spécificité variable inhibitricesTravail de développement intensif Anti-sense DNA Facile Efficacité variable peu onéreux Spécificité variable Nécessite une transfection RNA interferenceSpécifiqueKnock-down (pas knock-out) Relativement facileNécessite une transfection

3 Antisens (ssDNA): un autre mécanisme pour le blocage de lexpression des gènes 3 modes dintervention des antisens dans la cellule: dégradation par la RNaseH arrêt de transcription régulation de la maturation des ARN (de: + Scherer et Nature , p1457)http://www.isispharm.com Hybridation AS+ARN puis degradation:

4 La RNAissance 1998, RNA interférence : inhibition post- transcriptionnelle de lexpression de gènes après introduction dARNdb (nématode) Fire et al. 2001: siRNA dans des cellules de mammifères Elbashir et al. En 2002, Science magazine élit les RNAi comme la plus grande avancée technologique de lannée , association de la génomique fonctionnelle et du RNAi en oncologie (Oncogene)

5 LARNi: une nouvelle star biotechnologique Principe de linterférence ARN: Spécificité de la dégradation RISC (RNA-induiced sillencing complex)

6 siRNA (synthèse chimique) RNAi (viral) shRNA (small hairpin) Produit à partir de plasmides miRNA (micro : in vivo) Prêt à agir après phosphorylation Origines de siRNA Découpés par DICER en siRNA

7 Mode daction de linterférence

8 Design de siRNA Critères defficacité: >90% de réduction du niveau de la protéine. [siRNA] de 1 à 20 nM Éviter les régions 3 et 5 non codantes du gène.

9 Choix dune séquence siRNA Copier une séquence de 21 nt ayant les bons critères Sassurer que cette séquence est spécifique du gène à cibler (BLAST) Commander la séquence et son contrôle sous forme: - ARN synthétique - ADN NB:Il faut choisir au moins 3 siRNA pour cibler un gène.

10 Méthodes de production des siRNA MéthodesAvantagesInconvénients Synthèse Rapide RNAi Transitoire Chimique Nécessite une transfection Chimique: grande puritéChimique: cher DNA (vecteur ou casette) moins cher Très laborieux RNAi stable possibleNécessite une transfection Vecteur viral RNAi stable Très laborieux Utilisable pour des cellulesPotentiellement dangereux résistantes aux transfections par dsRNA/plasmides

11 Comment introduire le siRNA dans une cellule de mammifère? Par transfection de lARN ou de lADN (différents agents lipophiles) Par électroporation Par infection virale (adenoV*; retroV; lentiV) Comment introduire le siRNA dans un animal? Par électroporation par injection intra péritonéale Par injection intraveineuse (apolipoprotéine B)

12 shRNA transgénique génération of knockdown pour des lignées ES Transgenic RNA interference in ES cell-derived embryos recapitulates a genetic null phenotype (May 2003, 21, 5 pp ), Nature: Kunath et al. Exemple: production stable de shRNA du gène p120- Ras GTPase-activating protein (RasGAP) Il est possible de concentrer sur un seul allèle: grand intérêt en génétique (dirigé contre une mutation dominante, exemple le gène Tau dans les troubles neurologiques)

13 Comment quantifier leffet RNAi? Au niveau de lARNm –Par Northern blot –Par RT-PCR Au niveau de la protéine –Par Western Blot –Par immunofluorescence –Par cytométrie en flux –Par des tests phénotypiques ou fonctionnels

14 Applications Génétique inverse (découvrir la fonction inconnue dun gène connu). Combinaison de linterférence ARN et de la génomique (découvrir des gènes inconnus à partir dun phénotype connu).

15 Inhibition par RNAi de linfection par HIV-1 de lymphocytes T humains Approche combinatoire

16 Applications Génétique inverse (découvrir la fonction inconnue dun gène connu). Combinaison de linterférence ARN et de la génomique (découvrir des gènes inconnus à partir dun phénotype connu). Banques de siRNA.

17 Préparation dune banque de siRNA

18

19 Le premier criblage RNAi Stanford's Pat Brown looking at RNAi in genomewide expression profiling PNAS's May 27 (2003) p1073. Depuis,quelques publications… La difficulté de créer de bonnes banques de siRNA, puis davoir un phénotype facile à mesurer sur des cellules cultivées et tranfectées au format de criblage à haut débit, explique la faible abondance de publications dans le domaine.

20 Perspectives de thérapie anticancéreuse par ARN interférence Ciblage de molécules impliquées en carcinogenèse * voies doncogenèse (PTK, APC, PI3K HIF-1…) * Régulateurs du cycle cellulaire (RB, P53, cyclines…) * Apoptose (BCL2…) * sénescence (télomérase) * Stabilité et dégradation des protéines (cathépsine L)

21 Perspectives de thérapie anticancéreuse par ARN interférence Ciblage de gènes impliqués dans les interactions hôte-tumeur Gènes importants pour langiogenèse (VEGF, angiogènine… Gènes importants pour la dégradation de la matrice extracellulaire (u-PA Gènes importants pour linvasion et les métastases Gènes de ladhésion cellulaire

22 Perspectives de thérapie anticancéreuse par ARN interférence Ciblage de gènes important pour la résistance tumorale à la chimio et/ou radiothérapie Gènes MDR Molécules liées aux mécanismes de réparation de lADN ERCC1…

23 Biblio RNA interference collection Nature reviews Mai Prospects of RNA interference therapy for cancer gene therapy


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