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La PCR en temps réel Exemple d'utilisation au laboratoire de Bactériologie de l'hôpital Pellegrin Sabine Pereyre.

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1 La PCR en temps réel Exemple d'utilisation au laboratoire de Bactériologie de l'hôpital Pellegrin Sabine Pereyre

2 PCR conventionnelle Taq Dénaturation (95°C) Hybridation des amorces Elongation (72°C) cycles ADN, amorces, dNTP, Taq pol

3 PCR conventionnelle 1- Extraction (manuelle ou automatisée) 2- Amplification 3- Révélation : Electrophorèse sur gel d'agarose (1-2%) Taq + -

4 Cinétique de la PCR

5 Phase exponentielle Phase plateau

6 - Haute précision pendant la phase exponentielle - Variabilité importante à la phase plateau PCR en temps réel PCR "classique" en point final PCR conventionnelle versus en temps réel

7 PCR en temps réel Basée sur la détection d'un "reporter" fluorescent Signal proportionnel à la quantité d'amplicons Signal détecté "en temps réel" 1- Extraction (manuelle ou automatisée) 2- Amplification et détection synchronisée Système fermé, pas de manipulation post-amplification Rapidité Faible risque de contamination

8 PCR conventionnelle versus en temps réel PCR conventionnelle Gel d'agarose PCR en temps réel Courbe de fluorescence

9 PCR en temps réel - Quantification Valeurs de fluorescence corrélées à la quantité de produit amplifié Concept de "cycle seuil" (Ct) : base de la quantification Ct ( Cycle threshold) = nombre de cycle d'amplification nécessaire pour obtenir un signal fluorescent statistiquement significatif par rapport au bruit de fond (valeur seuil). Plus le Ct est petit, plus l'échantillon est concentré Seuil fixé au dessus du bruit de fond

10 Dérivée de la fluorescence Nbre de cycles Ct

11 Quantification – courbes de calibration Nombre de cycles Fluorescence émise (UA) Nombre de copies (log) Cycle seuil - Ct Log N = -0,26 Ct + 10,85 R 2 = 0,998 Ct 1 Echantillon Inconnu : Ct =25

12 Génération de la fluorescence 1- Agent se liant à l'ADN double brin : STBR Green I 2- Utilisation de sondes Hydrolyse de sondes : sondes Taqman Hybridation de deux sondes : FRET (Fluorescence Resonnance Energy Transfert) Molecular Beacons (balises moléculaires)

13 Principe du SYBR Green I = Agent intercalant dont l'émission de fluorescence augmente lorsqu'il est lié à l'ADN double brin hעhע F Après amplification F ADN double brin hעhע Avant amplification SYBR Green Le SYBR Green en solution émet peu de fluorescence Durant l'élongation, il se fixe sur l'ADN double brin naissant, entraînant une augmentation de la fluorescence

14 Principe du SYBR Green I L'émission de fluorescence est mesurée à la fin de chaque cycle d'élongation (l'émission de fluorescence décroît lorsque l'ADN est dénaturé à l'étape suivante)

15 SYBR Green Avantage - Inconvénients Avantage - Economique - Facile d'utilisation - Pas d'expertise particulière pour le design de sondes fluorescentes - Non affecté par des mutations de l'ADN cible (qui affectent l'hybridation des sondes spécifiques) Inconvénients - La spécificité repose entièrement sur les amorces - Faux positifs, surestimation de la quantification (le SYBRgreen se fixe à n'importe quelle molécule d'ADN double brin y compris des produits non spécifiques ex : dimères d'amorces, mauvais appariements) Analyse de la courbe de fusion indispensable

16 Analyse de la courbe de fusion - Chaque produit d'amplification est caractérisé par son Tm (température de fusion = melting temperature) = température pour laquelle 50% de l'ADN double brin est dissocié - Le Tm d'un produit d'amplification est mesuré en suivant l'évolution de la fluorescence lorsque la température augmente - Deux produits de PCR diffèrent par leur Tm il est possible de détecter des produits non-spécifiques, des dimères d'amorce

17 Analyse de la courbe de fusion Température °C Dérivée de la fluorescence Tm =87°C

18 SYBR Green Nombre de cyclesTempérature °C Fluorescence Courbe de fusionCourbe d'amplification Ct : quantification Tm : spécificité du produit d'amplification

19 Génération de la fluorescence 1- Agent se liant à l'ADN double brin SYBR Green I 2- Utilisation de sondes Hydrolyse de sondes : sondes Taqman Hybridation de deux sondes : FRET (Fluorescence Resonnance Energy Transfert) Molecular Beacons (balises moléculaires)

20 Sondes Taqman - Principe Hybridation d'une sonde spécifique Composition de la sonde Fluorochrome émetteur (reporter) en 5' Ex : FAM 6-carboxy-fluorescein Fluorochrome suppresseur (quencher) en 3' ex : TAMRA 6-carboxy-tetramethyl- rhodamine pas d'émission de fluorescence

21 Cette méthode repose sur deux principes : - la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer) - lactivité 5-exonucléase de la Taq Pol Spécificité des amorces pour la PCR Spécificité de lhybridation de la sonde TaqMan FP RP Reporter Quencher FAM, VICTAMRA Sondes Taqman - Principe

22 FP RP R Q Lumière - FRET (fluorescence resonance energy transfer) depuis le reporteur (haute énergie) vers le quencher (faible énergie), pas de signal fluorescent émis par le reporteur quand la sonde est intacte Sondes Taqman - Principe

23 - au cours de lélongation catalysée par la Taq Pol lactivité 5 nucléase coupe la sonde libération du reporter FP RP R Q FP RP R Q - lorsque la polymérisation est complétée, pour chaque molécule dADN synthétisée un reporteur émet de la fluorescence.

24 La fluorescence est proportionnelle aux taux d'hydrolyse de la sonde hybridée donc à la quantité de produit d'amplification

25 Sondes Taqman Avantage : - Spécificité accrue Spécificité des primers pour la PCR Spécificité de lhybridation de la sonde TaqMan - Possibilité de multiplexage avec des sondes portant des fluorochromes différents Inconvénient : - Impossibilité de réaliser des courbes de fusion

26 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) Utilisation de 2 sondes linéaires complémentaires d'une séquence cible - Une sonde marquée en 3' par un marqueur fluorescent, qui émet une fluorescence verte - Une sonde marquée en 5' par un fluorochrome accepteur, qui émet une fluorescence rouge Hybridation "tête à queue " sur l'ADN cible proximité des fluorochromes Transfert d'énergie fluorescence rouge En solution, bruit de fond de fluorescence verte Pendant l'hybridation, fluorescence verte

27 FRET Dénaturation Hybridation Elongation L'acquisition du signal se fait pendant l'hybridation. L'accroissement de fluorescence rouge est proportionnel à la quantité d'ADN synthétisé

28 Molecular beacons = sonde d'hybridation en épingle à cheveux appelée balise moléculaire - Une boucle : séquence complémentaire d'une séquence cible de l'ADN - Deux bras de séquences complémentaires - Un fluorochrome émetteur (ex : FAM, ROX, TET) - Un fluorochrome suppresseur, non fluorescent. Il dissipe l'énergie de l'émetteur en chaleur (FRET) Fluorochrome émetteurFluorochrome suppresseur = quencher

29 Molecular beacons 1- Dénaturation 2- Hybridation 3- Elongation La sonde s'hybride préférentiellement à sa séquence cible complémentaire sur la matrice Emission de fluorescence balises libres : pas de fluorescence Libération de la balise : pas de fluorescence

30 Molecular beacons Avantages - Très spécifique : détections des SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) Si la séquence cible ne correspond pas parfaitement à la balise moléculaire, pas d'hybridation donc pas d'émission de fluorescence (formation en épingle à cheveux thermodynamiquement plus stable) Inconvénient - Difficulté du design des sondes d'hybridation

31 Les appareils de PCR en temps réel

32 LightCycler (Roche Diagnostics) Utilisation de fins capillaires en verre permettant une optimisation des échanges thermiques Rotor de 32 places

33 GeneAmp 5700 et Prism 7000 (Applied Biosystems) GeneAmp 5700 ABI Prism 7000 Réactions en plaque de 96 puits

34 COBAS Taqman (Roche Diagnostics) (48 tests) COBAS Taqman 48

35 Icycler (BioRad) Réactions en plaque de 96 puits

36 MX4000 (Stratagene) et Rotor Gene (Corbett Resesarch) MX4000 Rotor Gene

37 SmartCycler (Cepheid) Tubes réactionnels conçus pour optimiser les échanges thermiques et la sensibilité optique Chaque tube peut fonctionner avec un programme indépendant

38 Principaux appareils de PCR en temps réel

39 Avantages PCR en temps réel /PCR conventionnelle PCR conventionnellePCR temps réel Préparation de l'échantillon (lyse de l'organisme, purification des AN) Manuel Automatisé Manuel Automatisé Amplification et détectionPlusieurs étapes Système ouvert Intégré Simultané Système fermé Système de détectionGels Radio-isotopes Enzymes Fluorochromes Temps d'analyse4h à 48h20 min à 2h Taux de contaminationMoyen à fortFaible Taux de quantification2-3 log5-6 log ReproductibilitéBonne intra-labo Mauvaise inter-labo Grande (théoriquement) TraçabilitéDétection, enregistrement et analyses intégrés CoûtGel : 4-5 eurosSYBR Green : 4-5 euros Sondes : 10 euros

40 1- Diagnostic bactériologique PCR qualitative ou quantitative 2- Etude de la résistance aux AB 3- Typage bactérien (génotypage) Apport de la PCR en temps réel en Bactériologie

41 1- Diagnostic bactériologique Exemple 1: Mycoplasma pneumoniae (TP jeudi) - Bactérie responsable d'infections respiratoires chez l'enfant et l'adulte jeune Culture difficile, peu sensible, en 3 semaines Antibiotiques classiquement utilisés (β-lactamines) inactifs A Pellegrin Extraction automatisée (MagNAPure, Roche diagnostic) PCR en temps réel Taqman sur ABI Prism 7700, gène de l'adhésine P1

42 Témoin + : culture de Mpn extraite et amplifiée pure, 1/10 ème, 1/100 ème, 1/1000 ème pur

43 En rouge : patient positif pour M. pneumoniae Patient

44 Diagnostic bactériologique Exemple 2 : Chlamydia trachomatis (TP vendredi) - Bactérie responsable d'infections génitales souvent inapparentes chez l'homme et la femme. Complications: stérilité féminine Bactérie intracellulaire culture cellulaire difficile A Pellegrin - Extraction automatisée (MagNAPure, Roche diagnostic) - PCR en temps réel Taqman sur COBAS Taqman

45 Diagnostic bactériologique Exemple 3 : Neisseria meningitidis (méningocoque) - Bactérie responsable de méningites graves. Diagnostic et traitement antibiotique sont une urgence vitale. Nécessité d'une prophylaxie pour l'entourage (AB ou vaccin) la culture bactérienne nécessite 24 heures A Pellegrin - Culture classique - PCR en temps réel SYBR Green (gène ctrA, Pr de mb externe)

46 Amplification du gène ctrA de N. meningitidis Témoin + patient

47 Témoin + patient eau

48 Diagnostic bactériologique à Pellegrin GermesGènes Principaux échantillons ExtractionAmplification 1 Intérêt M. pneumoniae Adhésine P1 (P de mb) RespiratoiresMagNA PureTaqManCulture difficile C. pneumoniae PMP4 (P de mb) Respiratoires MagNA PureTaqMan Culture exceptionnelle C. psittacci IncA (P mb d'inclusion) respiratoiresMagNA PureTaqman Culture facile mais secteur protégé P3 C. trachomatis Plasmide cryptique Génitaux Urine MagNA Pure -COBAS Amplicor -Taqman (COBAS Taqman) Culture difficile (cellulaire) M. genitaliumAdhésine MgPa Génitaux Urine MagNA PureSYBR Green puis Taqman Culture impossible M. tuberculosis (BK)ARNr 16S Respiratoires LCR, divers Kit COBAS COBAS Amplicor (PCR ELISA pt final) Culture très lente N. meningitidis ctrA (P de mb externe) LCRManuelle 2 SYBR Green Diagnostic d'urgence B. pertussis B. parapertussis IS 481 IS 1001 RespiratoiresMagNA PureSYBR GreenCulture difficile S.aureus (+/- mecA) Fragment sa442 mecA Souche isoléeManuelle 2 SYBR Green Si identification difficile PCR universelle 16S (pt fragment bactérien) ARNr 16S Prélèvements divers Manuelle 2 ou MagNAPure SYBR Green Contrôle d'extraction PCR universelle 16S (grand fragment) ARNr 16SSouche isolée Manuelle 2 ou MagNAPure SYBR Green Identification bactérienne 1 Amplification par PCR en temps réel sauf COBAS Amplicor 2 Extraction manuelle avec un tampon de lyse (Triton, Tween, Tris-EDTA) Ebullition 10 min centrifugation surnageant

49 2- Etude de la résistance aux antibiotiques Exemple : Etude de la résistance à la clarithromycine chez H.pylori H.pylori : bactérie responsable de l'ulcère gastro-duodénal Clarithromycine: AB utilisé en association en 1ère intention Résistance par mutation ponctuelle d'une base de l'ARNr23S, cible de cet AB (20% des souches) A Pellegrin PCR en temps réel, FRET sur Lightcycler

50 FRET: Hybridation "tête à queue " sur l'ADN cible proximité des fluorochromes Transfert d'énergie fluorescence rouge - S'il y a une mutation sur l'ADN cible, la sonde (rouge) est moins bien hybridée - Si on augmente la température, elle se détachera plus facilement Mutation Réalisation de courbes de fusion 2- Etude de la résistance aux antibiotiques

51 Mismatch (mutation) Hybridation parfaite Température basse moyenne élevée FluorescencePas de fluorescence Fluorescence si hybridation parfaite mais pas si mutation

52 Sauvage AAA ACA AAG AGA Mutations Si mutation, le Tm est plus faible Technique réalisable directement à partir des biopsies gastriques

53 3- Typage bactérien - Typage bactérien : identifier les différents "types" ou les différentes souches d'une espèce bactérienne - Intérêts nombreux Ex : identifier une épidémie liée à une même souche Ex : identifier un type plus virulent, résistant aux AB, etc… Exemple : typage des souches de méningocoque à Pellegrin - Il existe plusieurs sérogroupes : A, B, C, Y, W135 Des vaccins existent contre les sérogroupes A, C, Y, W135 mais pas contre le sérogroupe B - Objectif du typage : si diagnostic de N. meningitidis, peut-on vacciner les sujets contacts? Si oui, avec quel vaccin?

54 Détermination du sérogroupe de N.meningitidis - Amplification du gène siaD (biosynthèse de la capsule des sérogroupe B, C, Y et W135) ou ou mynB (biosynthèse des polyosides de capsule du sérogroupe A). - Amorces spécifiques, différentes selon les sérogroupes - PCR temps réel SYBR Green sur ABI prism 7000 durée 2-3 heures

55 Recherche du sérogroupe B Témoin + patient

56 Recherche du sérogroupe C Témoin + patient

57 Confirmation : analyse de la courbe de fusion Témoin + patient

58 Recherche du sérogroupe W135 Témoin + patient

59 Conclusion Avantages de la PCR en temps réel Automatisation Rapidité Spécificité Sensibilité Faible risque de contamination Place dans un laboratoire de Bactériologie Diagnostic de bactéries non ou difficilement cultivable Diagnostic d'urgence Etude de la résistance aux AB de bactéries difficilement cultivables Typage moléculaire

60 fluorescence nbre de cycles

61 TaqMan® MGB probes NFQ non fluorescent quencher Nouvelle innovation MGB minor groove binder stabilise les 5 à 6 dernières bases de la sonde (à son extrémité 3) sonde plus courte et plus spécifique (pour un Tm donné)


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