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Identification de gènes impliqués dans le développement des lymphomes cutanés primitifs CD30+ Laboratoire dHistologie et Pathologie Moléculaire des Tumeurs.

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1 Identification de gènes impliqués dans le développement des lymphomes cutanés primitifs CD30+ Laboratoire dHistologie et Pathologie Moléculaire des Tumeurs EA Université Victor Ségalen Bordeaux 2 Directeur de thèse : Jean Philippe Merlio Thèse présentée par Emilie Loreau

2 Lymphomes IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Définition Prolifération maligne de lymphocytes B ou T Localisation principale dans les tissus lymphoïdes Monoclonalité Lymphoproliférations CD30+ Lymphome cutané primitif (LCP) CD30+ Papulose lymphomatoïde (Ply) Lymphome systémique CD30+ Peau Ganglion

3 Antigène de surface CD30 IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Expressions - Lymphocytes T activés sanguins (15%) - Lymphoproliférations CD30+ Famille du TNF-R Fonction Récepteur transmembranaire (120 kDa) NF-KB CD30L CD30 Membrane plasmique MAPK TRAF

4 Lymphome cutané primitif CD30+ IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Classification9 % des lymphomes cutanés primitifs (EORTC) CliniqueTumeur cutanée, régression spontanée, récidive Age60 à 70 ans PronosticSurvie à 5 ans 95%, si extension extra-cutanée 25% HistologieNon épidermotrope, infiltrat dense PhénotypeLymphocytes T exprimant le CD30+ (70 %) GénotypeRéarrangement clonal du gène du TcR : (70 %)

5 Lymphome cutané primitif CD30+ IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Epiderme Derme Prolifération tumorale LCP CD30+ Patient Peau Saine Hypoderme Derme Epiderme

6 Papulose lymphomatoïde / LCP CD30+ IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Ply type APly type C Autre cas frontière LCP CD30+ Histologie Cellules CD30+ Cellules inflammatoires dispersées nombreuses en amas +/- rares dispersées nombreuses en amas +/- rares Clinique Lésions Distribution Evolution Régression spontanée Atteinte extra-cutanée toujours exceptionnelle toujours exceptionnelle 50 % rare 30 % 25 % papule>nodule généralisée nodule>tumeur loco-régionale

7 L. systémique CD30+ / LCP CD30+ IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats L. systémique CD30+LCP CD30+ Age Bimodal : 20 et 70 ans60 à 70 ans Clinique Agressif Atteinte extra-ganglionnaire, osseuse ou cutanée (20/30 %) Non agressif Tumeur cutanée souvent localisée Atteinte extra-cutanée, ganglionnaire (25 %) Histologie Infiltrat diffus détruisant larchitecture du ganglion Infiltrat dense non épidermotrope Phénotype T, nul ou rarement B, CD30+T ou nul, CD30+ Génotype Réarrangement clonal du TcR t(2;5) > 50 % Réarrangement clonal du TcR Pronostic : survie à 5 ans 77 % chez le sujet jeune 54 % pour les sujets âgés 95 % Extension extra-cutanée : 25 %

8 Gènes et cancers IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Oncogène Activation du cycle cellulaire Inhibition de lapoptose Mutation dominante Gène suppresseur de tumeur Inhibition du cycle cellulaire Activation de lapoptose Mutation récessive Colon sain Cancer + Métastases Cancer APC K-Ras DCC p53 …

9 Objectif IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Oncogenèse du LCP CD30+ ? Aide au diagnostic Cible thérapeutique Voies de transduction Etude du transcriptome

10 IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Approches globales Puce à ADNc mRNA differential display SSH « Substractive Suppressive Hybridization » Approches ciblées RT-PCR RT-PCR en temps réel

11 Stratégie IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Banque soustraite Macro-array RQ-PCR ? Réalisation de banques par SSH Criblage des banques Validation des gènes candidats

12 Principe de la SSH IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Diatchenko et al, 1996 Comparaison de deux populations cellulaires différentes : tester et driver Gènes spécifiques de la population cellulaire tester But Mise en évidence de gènes spécifiques dune population cellulaire Normalisation entre les ARNm fortement ou faiblement représentés Suppression des gènes présents dans les deux populations

13 Etapes de la SSH IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats AAAA tester ou driver tester RT RsaI Ligation PCR Clonage Hybridations

14 SSH IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats PCR2 PCR1 a, c et d b Tester 1 Tester 2R Driver H1b H1a a b c d abcd+eabcd+e H2 Ex a b c d e

15 Choix des échantillons IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Prélèvement de la tumeur cutanée Lymphocytes tumoraux ARN totaux Prise de sang Lymphocytes sanguins ARN totaux DriverTester 18S 28S ARN dégradés

16 SSH IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Etapes critiques IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Digestion des ADNc par RsaI (tester et driver) Gel dagarose 2 % w/v 1.Marqueur PM 100 pb 2.Tester 1, lié 3.Tester 1, lié ou non 4.tester 2R, lié 5.tester 2R, lié ou non 1 2 Gel dagarose 1,2 % w/v 1.ADNc non digéré 2.ADNc digéré Ligation des adaptateurs pour créer deux populations tester

17 S NS S NS M Validation dune banque SSH IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats S NS Soustrait Non Soustrait Clonage dans le pGEM T vector 8 SSH réalisées 3 SSH validées 4 SSH criblées PCR1PCR2 Efficacité de soustraction

18 Criblage des banques soustraites IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Organisation des banques sur membranes Clonage T C G A G T C A Séquençage Hybridation des sondes radioactives But Diminuer le nombre de faux positifs S NS PCR2

19 A partir des clones IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Sonde tumorale Sonde non tumorale Organisation des clones en deux boites homologues : grille à 228 positions Transfert des bactéries sur membrane de nylon Fixation de lADN des bactéries sur les membranes Hybridation des sondes radio-marquées

20 Par Dot Blot IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats TumeurNon tumeur Organisation des clones dans des plaques de 96 puits PCR à partir des clones en suspension (amorces M13) Fixation des produits de PCR sur deux membranes de nylon par Dot Blot Hybridation des sondes radio-marquées

21 Résultats du criblage IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats 2230 spots349 clones Criblage 118 gènes candidats Séquençage Dot Blot : 15 gènes THW Humanine Bibliographie : 16 gènes PTTG1 Bcl11BCIN85 SPARCp120 cat + Validation RQ-PCR

22 Résultats du criblage IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Kératine 6 Annexes cutanées Surexpression dans un environnement prolifératif ARN 18S Track de A Surexpression dans les cellules tumorales CMH II Fortement exprimé dans les lymphocytes T activés Importance du choix des échantillons

23 Validation des candidats IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats PCR en temps réel ou RQ-PCR Normalisation par PO (gène de ménage) Quantification relative (tumeur par rapport à non tumeur) Augmenter le nombre déchantillons testés But Vérifier par une autre technique les variations dexpressions

24 RT-PCR en temps réel IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Transcription inverse 2 g 11 cas de LCP CD30+ 7 tumeurs initiales 3 récidives 1 ganglion 2 cas de L. systémique CD30+ 7 lymphocytes sanguins sains Echantillons testés

25 RT-PCR en temps réel IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Amplification avec des amorces spécifiques du gène dintérêt Utilisation dun intercalent fluorescent : le SYBR-Green Mesure de la fluorescence en fin délongation Intensité de fluorescence quantité de cible Amplification par PCR

26 T- 3 mM 5 mM 4 mM Cinétique Ct Exemple de résultats IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats T- 3 mM 4 mM 5 mM Courbe de fusion [MgCl 2 ] pour le gène PO

27 Choix dun gène de ménage IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Choix des amorces : GAPDH, G6PD, PO, -actine Etude sur 14 échantillons dont 4 tumeurs LCP CD30+ Travail en duplicate et en Ct

28 Choix dun gène de ménage IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Gène de ménage GAPDH Gène de ménage actine

29 Analyse des résultats de RQ-PCR IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats x RQ-PCR en duplicate sur chaque échantillon Moyenne des Ct des duplicates (0,3) Gamme de dilution [concentration arbitraire] Normalisation : [Gène dintérêt] [PO] Gènes dintérêts Gène de ménage PO

30 Résultats RQ-PCR relative IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats THW (11) p120 caténine (7) SPARC (5) PTTG1 (9) Surexpressions 31 candidats étudiés sur 13 échantillons Sousexpressions Humanine (9) CIN85 (7) Bcl11B (7)

31 Gènes Surexprimés - THW IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Hildebrandt et al, 2000 et 2001 Perte dhétérozygotie fréquente en 6q Mélanome sans métastase : 10 à 20 % Mélanome avec métastases : 50 % THW et kératine 6 : même profil dexpression ! THW fortement exprimé dans les cellules épidermiques Gène suppresseur de tumeur

32 MP p120 E-cadhérine cat actine cat Gènes Surexprimés - p120 caténine IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Surexpression : cancer gastrique Sousexpression : autres cancers Noyau ? Kasio X p120 Quels sont les gènes inhibés dans les lymphocytes T ? Anastasiadis et Reynolds, 2001

33 Gènes Surexprimés IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Oncogènes JUN-B surexprimé dans LCP CD30+ Tumeurs initiales (facteur 4) Récidives (facteur 8 à 15) c-jun SPARC AP1 SPARC Briggs et al, Mao et al, 2003 Glycoprotéine MEC Surexpression : certains cancers Surexpression : Lymphoproliférations T (70 %) Ségrégation des chromatides (mitose) PTTG1 Tumeurs initiales Pey et Melmed, Saez et al, 2002

34 Gènes sousexprimés IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Protéine doigt de zinc nucléaire Cerveau, système immunitaire Lymphomes du thymus (souris) : Délétions homozygotes Bcl11B Wakabayashi et al, 2003 Gène suppresseur de tumeur Protéine adaptatrice Prolifération/apoptose ? PI3K CIN 85 Apoptose (neurones) CIN85 Take et al, Gout et al, 2000 Hashimoto et al, Guo et al, 2003 Peptide anti-apoptotique (24 aa) Séquence homologue à lARN 16S Humanine Oncogène Humanine Apoptose Bax

35 Conclusion IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Trois gènes sousexprimés Bcl11B : gène suppresseur de tumeur CIN85 Humanine Quatre gènes surexprimés dans les LCP CD30+ SPARC et PTTG1 : oncogènes p120 caténine THW : biais expérimental (choix des échantillons de départ) Fonction oncogénique ou phénotype

36 Perspectives IntroductionConclusionBanque SSHCriblage banqueValidation candidats Augmenter le nombre des échantillons analysés : Marqueurs ? ISH ou microdissection : localisation des ARNm Immunohistochimie : localisation et niveau dexpression protéique SSH et CGH ? Voies de signalisations impliquant les différents gènes CIN85 : recherche des partenaires - immunoprécipitation (prolifération ou apoptose) JUN-B et SPARC p120 et Kasio

37 Ce travail a été réalisé sous la direction du Pr. Jean Philippe Merlio Financement : Programme de Recherche Clinique dAquitaine Pr. Jacques Emile Bonnet Pr. Gilles Favre Pr. Pierre Brousset Remerciements Pr. Marie Beylot Barry Dr. Béatrice Vergier Dr. Marie Parrens Laboratoire du Pr. Merlio Dr. Nathalie Carrère Jackie Ferrer Dr. Edith Chevret Laboratoire du Pr. De Mascarel Mme Beau Labo Bio Mol Endocube

38 Et aussi ! Christine Bartoli Michelle Turmo Jean Christophe Garoste Jean Christophe Cometta Martina Prochazkova Alexis Groppi Henri Gomez Pierre Dubus Marc Antoine Belaud Rotureau Nicolas Bitteau Brigitte Tauzin Christophe Barthe Fanny Pelluard Armelle Bolzec Lilian Sylvain Caillol Ma famille et mes amis pour leur soutien permanent Cédric Barrière Peyo Dominique Bertheau


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